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本课件围绕细菌药物敏感试验及其耐药表型检测展开,系统讲解纸片扩散法、肺炎链球菌与药敏试验,依次梳理纸片扩散法、Etest法等章节要点,并给出检验流程与结果判读提示,配合逐页图示帮助掌握本部分的检验思路与操作规范。
第4章细菌药物敏感试验及其耐药表型检测
抗菌药物敏感试验测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验(Antimicrobial SusceptibilityTest),简称药敏试验(AST)。
;指导抗菌药物的临床应用;发现或提示细菌耐药机制的存在,能帮助临床医生选择合适的药物,避免产生或加重细菌的耐药;监测细菌耐药性,分析耐药菌的变迁,掌握耐药菌感染的流行病学,以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。
1.MIC的分布2.药代动力学和药效学定MIC的折点3.临床疗效和细菌清除率4.抑菌圈直径的分布………定抑菌圈折点统计学的线性回归计算错误率:尽可能减少极重要误差(假敏感率)
MIC的分布
MIC与抑菌圈直径的线性关系耐药中介敏感RISLog2. MICD 1 d2抑菌圈直径(mm)v
抑菌圈直径与MIC的关系
(CLSI的定义)敏感(Susceptible)用常规用量治疗有效常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。耐药(Resistance)用常规用量治疗不能抑制细菌的生长MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
敏感性分类
(抑菌圈直径)MIC法:稀释法(肉汤、琼脂)自动化仪法抗生素连续梯度法(Etest )流式细胞仪
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度,在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。纸片扩散法(Kirby-Bauer法)
纸片扩散法
纸片扩散法
纸片扩散法
2025/9/1418纸片扩散法-影响因素MIC接种菌量细菌生长率抗生素含量、扩散性平皿厚度温度,预孵育时间
2025/9/1419纸片扩散法-标准化CLSI:美国实验室标准化委员会(Clinicaland Laboratory Standards Institute)每年修订更改包括质控新药的判定标准特殊耐药性的检测
2025/9/1420CLSI的法规规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控;规定常规测试报告的抗生素;不同的药判定标准不同;不同的菌判定标准也不同。
常规测试并报告的药物分
常规测试并报告的药物分
常规测试并报告的药物分
预报用药
预报用药
以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释(通常为双倍稀释),经培养后观察其最低抑菌浓度。稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法,用肉汤培养基者为肉汤稀释法。药敏试验-稀释法
常用抗菌药物容积稀释法最终浓度(g/mL)CAMHB(mL)体积(mL)来源浓度(g/mL)步骤51291储存液5120125611步骤1512212831步骤151236471步骤151243211步骤46451631步骤4646871步骤4647411步骤788231步骤789171步骤78100.511步骤101110.2531步骤101120.12571步骤10113
抗菌药物的稀释和融解
2025/9/1429肉汤稀释法481632 64 128 256 ug/ml混混清抗生素倍比稀释,种菌105CFU/ml,孵育35℃,16~20h,判读。
2025/9/1430肉汤稀释法调节离子浓度的MH肉汤宏量肉汤法(2ml, 13x100mm)微量肉汤法(0.1ml,微量板)自动化仪优点:准确,可靠,可用于研究。缺点:劳动强度大细菌生长情况不可查
2025/9/1431琼脂稀释法浓度163264 128 256 ug/ml制备含对倍抗生素浓度梯度的平板,制备菌悬液,点种菌,104/每个点,孵育,判读结果
Etest法
2025/9/14wanghui-ART34E test法细菌生长区E test塑料条椭圆形细菌生长抑制区2561288016判读抑菌浓度(MIC ug/ml)
E test法菌液制备及接种均同纸片扩散法。90mm平板上可放E试验试条1~2条,140mm平板最多可放6条。孵育温度及时间同纸片扩散法。
2025/9/1436E test法优点连续浓度梯度,与琼脂稀释法相关性好影响因素少,稳定性高操作简单,省时缺点:昂贵用途:快生长菌,苛养菌,厌氧菌,酵母菌,分枝杆菌
2025/9/1437评价药物体外抗菌活性的指标MIC50, MIC90, MIC均值,MIC范围,R,I,SMIC50/ MIC90:MIC从小到大排列,位于第50 / 90百分位菌株的MIC值单纯比较MIC50,MIC90是片面的,还要同时看平均MIC及MIC范围同时结合R,I,S,(不同药物血浓度不同,安全范围不同)
、头孢菌素类抗生素的灭活酶;该酶位于革兰阳性球菌菌体外,革兰阴性杆菌间质中;检测方法有微生物培养法、碘-淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速,应用于临床检测。
0.25g/ml-0.12g/mlMIC28 mm-29 mm纸片扩散法CLSI M100-S20. Table 2C.
诱导β-内酰胺酶的检测如果青霉素的药敏结果出现以下情况,需要做诱导β-内酰胺酶的检测:MIC ≤0.12 µg/mlZone diameter ≥29 mm
诱导β-内酰胺酶试验苯唑西林(诱导剂)-接种纯菌落于琼脂上(例如,BAP,MHA);-贴ß-内酰胺类纸片(例如,苯唑西林,头孢西丁);-孵育过夜;-测试抑菌圈周围的细菌;-如果β-内酰胺酶阳性,报告青霉素R。PosNeg
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶;ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物,能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制;
ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)纸片法
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)纸片法(表型确认试验)头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差≥5mm时,即可判断该菌产ESBL。
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)稀释法
超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)稀释法(表型确认试验)头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。
AmpC酶的特征AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的Ⅰ型β内酰胺酶,可分为诱导酶和非诱导酶。与ESBLs不同的是,AmpC酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制,但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。
AmpC酶的检测方法头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法;除此之外,还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpCDisk、头孢西丁琼脂基础法等。
碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的β-内酰胺酶,主要分布于β-内酰胺酶A、B、D类中。根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类:一类称为金属碳青霉烯酶,这类酶以金属锌离子为活性作用位点,可以被EDTA抑制,属于B类β-内酰胺酶;
另一类以丝氨酸(Ser)为酶的活性作用位点,可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制,属于A、D类β-内酰胺酶。
hodge试验ATCC25922,0.5麦氏,1:10稀释涂MH平板平皿中心贴10μg厄他培南或亚胺培南纸片10μl环挑取3~5个菌落从平板中心纸片边缘向平板边缘划线被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922抑菌环交汇处大肠埃希菌生长增强,即产碳青霉烯酶。
改良hodge试验的结果判读
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)携带SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a,这种蛋白对甲氧西林和其他的β-内酰胺类抗生素亲和力下降,从而导致对这些抗生素的耐药。SCCmec主要由mec复合物和ccr复合物两部分组成。
根据不同mec复合物和ccr复合物的组合,可以将SCCmec分成不同的型别,目前已发现8种SCCmec型。耐甲氧西林葡萄球菌
SCCmec基因盒
耐甲氧西林葡萄球菌的检测MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。对于金黄色葡萄球菌,MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片,但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。
MRS)稀释法纸片法药物MRS检测√√1g苯唑西林金黄色葡萄球菌√×1g苯唑西林路邓葡萄球菌√√30g头孢西丁金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌√×1g苯唑西林除路邓以外的凝固酶阴性葡萄球菌×√30g头孢西丁
MIC结果的报告策略*苯唑西林MIC (µg/ml)进行mecA或PBP2a或头孢西丁纸片扩散≤0.25≥4.00.5-2.0报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药阴性阳性报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药*检测无菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株
克林霉素诱导耐药试验
克林霉素诱导耐药葡萄球菌红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。*或其他大环内酯类
克林霉素红霉素耐药基因机制S*Rerm核糖体修饰-药物不能结合于靶位R结构性RSRmsrA泵-药物被泵出erm= erythromycin ribosome methylasemsrA= macrolide streptogramin resistance*需要诱导来显示耐药性红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制
erm介导)葡萄球菌-“D试验”患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药无克林霉素诱导(msrA介导)真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感“D”阳性阴性15~26 mm
MIC检测方法4.0µg/ml红霉素0.5µg/ml克林霉素No growth=无诱导性克林霉素耐药生长=诱导性克林霉素耐药
,克林霉素敏感的葡萄球菌,需检测诱导性克林霉素耐药注意试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐药株);对于CoNS,该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌;大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的;大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA基因型);克林霉素可以口服给药。
VISA)增厚的细胞壁耐药是由于:困难;表型不稳定检测不典型金葡菌菌落形态万古霉素敏感万古霉素中介细胞壁
MRSA(notVISA)VISA血琼脂
VISA-內酰胺类药物的MIC降低达托霉素MIC升高菌落形态不典型(一些为微小菌落)肉汤中生长迟缓(如血培养)凝固酶反应微弱/延迟经过几次次代培养后:菌落回复为典型形态万古霉素MIC降低并且菌株变为万古霉素敏感
VRSA)从万古霉素耐药肠球菌(VRE)中获得vanA基因耐药是由于9个患者美国报道例数大多数标准方法均可检测检测典型金葡菌菌落形态
vanA从VRE转至金葡菌vanA
纸片扩散法折点葡萄球菌-万古霉素
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纸片扩散法折点葡萄球菌-万古霉素Resistant耐药Intermediate中介Susceptible敏感CLSI文件--15M100-S18 2008---New!新M100-S192009*CLSI M100-S19. Table 2C.对于金黄色葡萄球菌*假如抑菌圈≥7 mm,用MIC法检测万古霉素(若有需要)•万古霉素纸片扩散法仅在检测携带van-A金葡菌(VRSA)时可信;需确证没有抑菌圈(≤6 mm)•纸片扩散法不能鉴别VSSA和VISA•纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌
肠球菌高水平氨基糖苷类耐药筛查纸片扩散法120 µg庆大霉素; 300 µg链霉素10 mm =无高水平氨基糖苷类耐药MIC筛查庆大霉素: 500 µg/ml链霉素: 1000 µg/ml (肉汤)2000 µg/ml (琼脂)
肠球菌氨基糖苷类修饰酶链霉素庆大霉素妥等
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肠球菌氨基糖苷类修饰酶链霉素庆大霉素妥布霉素阿米卡星/丁胺卡那6-AAD+---3’APH---+2”APH/6’AAC-+++6’AAC*--++*在所有屎肠球菌中均发现+ =酶可以修饰药物;药物无协同性-=酶不能修饰药物;药物有协同性
VRE)表型VRE-屎肠球菌中居多vanA-高水平耐药(MIC256 µg/ml)vanB-中等水平耐药(MIC 16-256 µg/ml)低水平万古霉素耐药vanC-(MIC 2-16 µg/ml)vanC天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌菌株不引起院内爆发,vanC基因不易于传播纸片扩散法实验可能检测不出
VRE菌种基因型动力MGP*有意义否?粪肠球菌vanA or vanB--是屎肠球vanA or vanB--是**铅黄肠球菌vanC + +否鹑鸡肠球菌vanC + +否*甲基化-a-D-葡糖苷酸化**黄色色素
,孵育3-5小时;甲基化-a-D-葡糖苷酸化=黄色阳性阴性铅黄肠球菌的黄色色素VRE
肺炎链球菌新的青霉素折点(µg/ml)耐药中介敏感84≤2青霉素注射(非脑膜炎)0.12-≤0.06青霉素注射(脑膜炎)20.12-1≤0.06青霉素(口服青霉素V)CLSI M100-S19. Table 2G.
肺炎链球菌纸片扩散法-使用苯唑西林纸片作为青霉素敏感性的替代纸片MIC (µg/ml)等效的MIC抑菌圈(mm)纸片药物含量SRSIR≤0.06-20--1µg苯唑西林青霉素CLSI M100-S19. Table 2G.
肺炎链球菌苯唑西林纸片法用于测定青霉素的敏感性20 mm-报告“敏感”:青霉素头孢噻肟/头孢曲松其他ß-内酰胺类19 mm-进行MIC实验:青霉素苯唑西林纸片敏感或20 mm对应脑膜炎或口服青霉素的敏感折点(MIC ≤0.06 µg/ml)CLSI M100-S19. Table 2G.
Etest MIC结果判读青霉素MIC的Etest测定肺炎链球菌MIC = 3g/ml
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