页数：130页文件大小：9.06 MB来源： 生物化学ppt课件
本课件系统讲解蛋白质化学，先概述蛋白质的多样功能与分类，再进入氨基酸部分，讲清α-氨基酸的构型、分类、两性解离与等电点计算、紫外吸收及茚三酮等特征反应，随后介绍肽键、肽链写法与谷胱甘肽等活性肽，最后展开蛋白质的结构层次、结构与功能的关系及其分离纯化与测定方法。
第四章 蛋白质化学
生命的概念
生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新。
蛋白质的生物学功能
蛋白质的概念
蛋白质（protein，简写pro):是由20种L-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具较稳定构象并具一定生物功能的生物大分子。
蛋白质的生物学功能
生物体的结构成分
运输和储存血红蛋白
运动作用：动物的肌肉收缩、细菌的鞭毛运动
免疫保护作用抗体
激素作用：胰岛素
、等7）、接受和传递信息的受体：受体蛋白等8）、控制细胞生长、分化：生长因子、阻遏蛋白9）、营养作用、记忆活动等方面起重要作用。
功能复杂：蛋白质功能的复杂性（酶催化功能受许多因素的影响，并表现出竞争性、可调节性等）蛋白质化学
蛋白质的分类
按溶解度：清蛋白、精蛋白、组蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、硬蛋白等。
分子组成简单蛋白结合蛋白
分子组成简单蛋白（按溶解度）结合蛋白（按辅基）清蛋白球蛋白谷蛋白醇溶蛋白精蛋白组蛋白硬蛋白核蛋白糖蛋白与蛋白聚糖脂蛋白色蛋白磷蛋白
按生物功能
活性蛋白质:包括在生命过程中一切有活性的蛋白质及其前体。
如:激素蛋白质、运输蛋白质、保护或防御蛋白质、毒蛋白质等。
非活性蛋白质：这类型蛋白质对生物体起保护或支持作用。
如：硬蛋白、角蛋白。
蛋白质的组成
蛋白质的元素组成：C、H、O、N 及少量的S特点：N在各种蛋白质中的平均含量为16%用定氮法可测定蛋白质含量：蛋白质含量(g) = 蛋白质含氮量×6.25蛋白质化学
氨基酸的化学
氨基酸（amino acid, 简写aa)：蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸。
天然蛋白质由20种氨基酸组成。
氨基酸的结构
α-氨基酸的构型
构型：由于基团或原子在空间排列的不对称性而引起的光学活性立体结构称立体构型。
天然单糖大多数是D-型糖
天然单糖大多数是D-型糖。
两型aa的生理功能不同。
α-氨基
氨基酸的种类及结构
天冬氨酸谷氨酸天冬酰胺谷氨酰
芳香族侧链：苯丙氨酸酪氨酸氨基酸的化学
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杂环氨基酸组氨酸色氨酸酸氨基酸的化学
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杂环亚氨基酸脯氨酸氨基酸的化学
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按R基团的极性分：极性氨基
酸：极性不带电荷：丝、苏、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪、半胱、极性带负电荷：天冬、谷、极性带正电荷：组、赖、精、非极性氨基酸：甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、甲硫、脯、色氨基酸的化学
按人体的概念
必需氨基酸：机体不能自身合成，必须由食物供给的氨基酸。
半必需氨基酸：人体可合成，但幼儿期合成速度不能满足需要。
非必需氨基酸：机体可自身合成的氨基酸。
非蛋白质氨基酸
非蛋白质氨基酸也具有生物活性。
氨基酸的重要理化性质
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aa解离
调整pH，使aa净电荷为零时，aa既不向阳极也不向阴极移动。
等电点规定aa净电荷为为零时的溶液pH
等电点（isoelectric point,缩写为pI）规定aa净电荷为为零时的溶液pH的为该aa的等电点氨基酸的化学
等电点的计算由式可知解离
常数：氨基酸的化学R-R+R ±K1=[R±][H+] [R+]K2=[R ±][R-][H+]
由此可知：已知在pI时
[R+]= [R-]，∴整理可得：K1 K2 =[R+]=[R±][H+] [R±] K2K1[R-]=[H+][R±][H+]K1=[R±] K2[H+][H+]2氨基酸的化学
两边取负对数：-lg [H+] 2=
-lg K1 －-lg K2 ∵-lg [H+] = pH-lg K1 =pK1-lg K2 =pK2∴2 pH = pK1 + pK2令pI为等电点时的pH，则pI = ½ （pK1+pK2）Gly：pI = ½（2 .4 + 9.6) = 5.97氨基酸的化学
对侧链R基不解离的中性氨基
由此可知:等电点相当于该aa两性离子状态两侧基团pK值之和的一半。
A、对侧链R基不解离的中性氨基酸：pI=1/2（pK1+ pK2）即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。
对有三个可解离基团的氨基
b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平均值。
如：天冬氨酸
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如赖氨酸
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pH＜pI：aa+ pH＞pI
pH＜pI ：aa+ pH＞pI：aa-用离子交换、电泳将aa分开c、处于pI时，aa溶解度最小，易沉淀；
可分离aa。
紫外吸收性质
只有芳香族氨基酸有紫外吸收能力，因其含有苯环共轭双键的R侧链。
色氨酸λmax：279nm所以，测样品280nm处的光吸收值，可知溶液中蛋白质浓度。
此法快速简便。
280nm有最大光吸收
氨基酸的重要化学性质
与茚三酮的反应：α-氨基酸与水合茚三酮溶液共热，引起aa氧化脱氨、脱羧，生成兰紫色化合物（Pro呈黄色），色深与溶液中氨基浓度成正比。
蛋白质的应用
应用：可定性或定量测定各种氨基酸。
a、根据颜色深浅，在570（440）nm处测OD值，可知样品中氨基酸含量。
b、定量释放的CO2可用测压法测量，计算出参加反应的aa量。
c、蛋白质和多肽亦可反应，但灵敏度差。
与甲醛反应
与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定
法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+ H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2
与亚硝酸的反应
与2,4-二硝基氟苯的反应
与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应NO2FO2N+ HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+ HF弱碱性DNP-氨基酸
H2N—CH—COOH +R
NCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.7 40℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH RDNS-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高
与异硫氰酸苯酯的反应
与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应—N=C=S + N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”
与荧光胺反应：根据荧光强度测定氨基酸含量
（ng级）。
H2N—CH2SSHNO
H2N—CHCH2SSHNO2HOOCSNO2COOHCOOH+SSNO2NO2HOOCCOOHH2N—CH—COOH +CH2SHpH8.0硫代硝基苯甲酸测定Cys含量
与金属离子反应
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纸层析
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肽——一个氨基
酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物。
氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。
当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。
氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（25个氨基酸残基以下）和多肽（多于25个氨基酸残基）。
多肽仍然有游离的α-氨基和α-羧基。
肽链写法：游离α-氨基在左，游离α-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。
肽链中的氨基
天然存在的活性肽活性
肽(active peptide)：存在于生物体内，具各种特殊生物学功能的肽。
谷光甘肽
（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG
催产素和升压素均为9肽，第3位和第8位氨基酸不同。
催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。
升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。
促肾上腺皮质激素
（ACTH）39肽，活性部位为第4~10位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。
脑肽脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。
Met-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。
胆囊收缩素
胰高血糖素由胰岛α-细胞分泌（β-细胞分泌胰岛素），29肽。
胰高血糖素调节维持血糖浓度。
蛋白质的结构
蛋白质的结构构型：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。
构象：指这些取代基团在单键旋转时可能形成的不同的立体异构体。
蛋白质的构象：指蛋白质特有的空间结构。
蛋白质的一级结构
蛋白质的一级结构是以肽键连接aa的线性序列。
肽（peptide)：一个氨基酸的α-羧基和另一氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物。
肽链的基本连接方式——肽键
肽键(peptide bond)：为1个氨基酸的α-氨基和另一氨基酸的α-羧基之间脱水后形成的共价键，即酰胺键。
此为蛋白质中氨基酸连接的基本方式。
C=O与—NH反式排列
C=O与—NH反式排列。
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肽链间/内的连接——二硫键
：蛋白质的结构概念：由肽链中相应部位上两个半胱氨酸脱氢连接而成，此称胱氨酸残基，是连接肽链内或肽链间的主要桥键。
赋予一定生物活力。
蛋白质的结构
例：胰岛素胰脏中胰岛β-细胞
分泌的一种蛋白质激素。
功能：降低血糖。
在A链内aa6和aa11间以二硫键连成小环。
多肽：多个氨基酸以肽键
另一端为游离羧基。
蛋白质的空间结构
概念：Pro空间结构又称Pro的构象（高级结构），指Pro分子中所有原子和基团在三维空间的排列及肽链的走向。
纤维状蛋白分子
：种类:角蛋白、胶原蛋白、血纤维蛋白、肌纤维蛋白。
功能:在生物体内保护、支持、结缔功能。
球蛋白分子：种类：血红蛋白
、肌红蛋白、清蛋白、球蛋白、酶蛋白、激素蛋白、抗体等。
蛋白质分子中的非共价键：蛋白质的结构
氢键：羰基上的氧与亚氨基上的氢原子所形成。
四级结构所需。
疏水键：aa非极性侧链形成。
作用：维持三级结构。
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带正负电荷的侧链通过静电引力形成
带正负电荷的侧链通过静电引力形成。
一般称原子、分子间或基团之间的短程作用力。
次级键的特点与作用
数量多。
所以，在维持蛋白质空间结构中起重要作用。
蛋白质的二级结构指蛋白
α-螺旋(α-helix)
因肽链中aa残基中的-NH与前三个aa的C=O间可形成氢键，使得肽链呈螺旋状盘曲。
氢键取向几乎与中心轴平行。
指蛋白
——质多肽链本身的折叠和盘绕方式α-螺旋（α-helix）Pauling和Corey于1965年提出。
结构要点：1）螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100°。
每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键（hydrogen bond），氢键的走向平行于螺旋轴，所有肽键都能参与链内氢键的形成。
理想的右a 螺旋
(a) 理想的右a 螺旋。
虚线代表氢键绿色：C蓝色：N红色：O 。
此(b) 右a 螺旋。
(c) 左a 螺旋。
β-折叠结构特点：肽链伸展
β-折叠(β-pleatedsheet)结构特点：肽链伸展，按层排列,在肽链的不同区段或不同肽链间形成氢键,维持结构的稳定性。
β-折叠
有两种类型平行：所有肽链的N端处于同一端，氢键不与肽链走向垂直。
如：β-角蛋白。
蛋白质的结构反平行：肽链的N端不处于同一端，氢键与肽链走向垂直。
如：丝心蛋白。
β-转角(β-turn)
链内形成氢键，多肽链出现180°的回折。
此回折角称β-转角结构。
此结构广泛存在球状蛋白中。
β-转角为了紧紧折叠
β-转角（β-turn）为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。
一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。
N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-转角经常出现在连接反平行β-折叠片的端头。
自由回转
指无规律的松散肽链结构。
通常酶蛋白的功能部位在此。
超二级结构蛋白质的结构
超二级结构(supersecondary structures)蛋白质的结构指若干相邻二级结构单元组合彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体。
此为二级结构与三级结构间的一种过渡构象。
等。
结构域
多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠而成的相对独立的三维实体称结构域。
具有部分生物学功能。
几种常见的结构域蛋白
质的结构蚯蚓血红蛋白的结构域四个α螺旋。
结构域与三级结构的关系蛋白
蛋白质三级结构
概念：指蛋白质多肽链上所有原子在三维空间的分布。
较大蛋白质分子：由2或2个以上结构域结合成三级结构。
蛋白质的四级结构
亚基(subunit)：几条肽链以非共价键联结成一稳定的活性单位，这种肽链称该蛋白质的亚基。
四级结构：亚基间通过非共价键聚合而成的特定构象。
蛋白质的结构血红蛋白:2个α亚基和2个β亚基。
胶元螺旋
蛋白质的四种结构层次
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蛋白质的结构
蛋白质的一级结构蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序。
蛋白质的空间结构一级结构卷曲、折叠而成。
通常分为二级结构、超二级结构、结构域、三级结构、四级结构。
一级结构确定的原则
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蛋白质分子结构与功能的关系
蛋白质一级结构与生物功能
一级结构的关键部分相同，功能相同
不同来源的胰岛素都由A、B链，51个aa组成，但一级结构的aa种类并不完全相同。
一级结构改变引起的分子
病：如：镰刀型贫血病血红蛋白仅一级结构：β6Glu换成β6Val由此引起三级结构多一疏水键，四级结构发生线性缔合，导致红细胞发生溶血。
分子病蛋白质分子一级结构
的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。
正常型---
(了解)由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束状，整个蛋白质由球状变为镰刀形，与氧结合功能丧失，导致病人窒息甚至死亡，但病人可抗非洲疟疾。
镰刀状贫血病—血液中大量出现镰刀红细胞
它是最早认识的一种分子病。
流行于非洲，死亡率极高，大部分患者童年时就夭折，活过童年的寿命也不长，它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变。
蛋白质构象与功能的关系
蛋白质构象改变，活性丧失。
蛋白质构象与功能
的关系别（变）构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。
因别构而产生的效应称别构效应。
血红蛋白是别构蛋白，O2结合到一个亚基上以后，影响与其它亚基的相互作用。
肌红蛋白血红蛋白在肺部O2的压力在毛细血管中O2的压力饱和度00.5120406080100120O2压力
蛋白质的性质
蛋白质的性质与其分子大小、结构及其组成——aa的性质密切相关。
Pr为高分子有机物，分子量几千—几千万。
聚丙烯酰胺电泳法等。
超离心法
在60 000～80 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动
沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。
凝胶过滤
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凝胶过滤法商品名
Sepharose-4BSephadex-G-75凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构
小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线logM=K1-K2Ve再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
电泳
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电泳
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电泳migration
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优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品
缺点：误差大，约为±10％（误差主要来源于迁移距离的测量误差）此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量
蛋白质分子
蛋白质分子体积很大,且表面水化作用(-R极性基团) →蛋白质液体流动阻力大→ 粘度大.如果表面带电荷→增加水化层厚度→使粘度更大.
由于蛋白质分子体积很大,不能透过半透膜,而小分子物质能透过半透膜,这样可把蛋白质分子与小分子物质分开,这个过程叫透析.
透析
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两性电离与等电点蛋白质的性质应用电泳
鉴定蛋白质的纯度。
此多用于科研、生产、临床诊断等。
胶体性质
蛋白质水溶液为亲水胶体。
布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）；
电荷作用。
蛋白质的沉淀反应蛋白
除去表面电荷1. 加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。
分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。
血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。
加有机溶剂3. 加重金属盐4. 加生物碱试剂和某些酸类沉淀剂单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸
蛋白质的变性
概念：许多理化因素能破坏pro分子三维结构中的氢键及其它弱键，导致pro活性丧失的现象。
分子表面结构改变：疏水基团暴露。
主要标志：生物功能的丧失。
三级结构
生物活性降低或全部丧失。
B 乙醇、丙酮等有机溶剂进入pr
C 脲溶液、盐酸胍及某些去垢剂(SDS)可破坏氢键，暴露巯基，强化酸碱的破坏作用。
温度降至37℃，恢复
可逆变性与不可逆变性可逆变性：凡变性未超过限度，pr活性可恢复;如：胃酶在80-90℃，失活；
温度降至37℃，恢复。
不可逆变性：变性不可恢复。
如：煮鸡蛋。
呈色反应试剂颜色反应
呈色反应反应试剂颜色反应基团双缩脲反应NaOH,稀CuSO4紫红色2个以上肽键Millon反应Millon,硝酸，亚硝酸红色酚基黄色反应HNO3 黄、橘黄苯环乙醛酸反应乙醛酸H2SO4紫红吲哚坂口反应次氯酸钠,萘酚，NaOH红色胍基Folin酚试剂反应磷钨酸-钼酸兰色酚基茚三酮反应茚三酮紫兰色游离氨羧基蛋白质的性质
本章小节
氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应、与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应
蛋白质的性质：大分子性质、蛋白质分子量的测定（离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）、两性解离（等电点、电泳、离子交换）、胶体性质、蛋白质沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白质变性、紫外吸收及颜色反应
九蛋白质的分离、纯化与测定
作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。
.蛋白质分离纯化的一般步骤材料的选择→原料的预处理→蛋白质的抽提→从抽提液中沉淀蛋白质→纯化→蛋白质的结晶
原料的选择：要求含待分离的蛋白质丰富，廉价，易得，容易收集，新鲜无腐败。
若待分离蛋白质为胞内蛋白质，则需要破碎细胞膜，再用适当的溶剂抽提。
3从抽提液中沉淀蛋白
质：常用盐析法、低温乙醇沉淀法、等电点沉淀法。
4纯化：将沉淀的蛋白质溶解，再选择适当的纯化方法，得到纯度比较高的蛋白质溶液。
纯化方法：透析或超滤、电泳法、凝胶过滤法、离子交换层析、吸附层析法、超速离心法等。
蛋白质的结晶：从溶液中重新沉淀蛋白质。
分离纯化的基本方法
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凝胶过滤层析原理
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氨基酸的分离
条件：5—10倍
的20%的盐酸煮沸回流16—24小时，或加压于120℃水解2小时。
优点：可蒸发除去盐酸，水解彻底，终产物为L—氨基酸，产物单一，无消旋现象。
缺点：色氨酸破坏，并产生一种黑色的物质：腐黑质，水解夜呈黑色。
碱水解条件：4mol/L Ba(OH)2 或6mol/L NaOH煮沸6小时。
优点：水解彻底，色氨酸不被破坏，水解夜清亮。
缺点：产生消旋产物，破坏的氨基酸多，一般很少使用。
蛋白酶水解条件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常温37—40℃，pH值5—8优点：氨基酸不被破坏，不发生消旋现象。
缺点：水解不完全，中间产物多。
蛋白质酸碱水解常用于蛋白质的组成分析，而酶水解用于制备蛋白质水解产物。
层析法的概念
层析法层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，这两个相一个为固定相，另一个为流动相。
当流动相流进固定相时，由于各组分在两相中的分配情况不同或电荷分布不同或离子亲和力不同等，而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。
电泳法电泳是指带电的颗粒在电场中向着以其颗粒所带电荷相反的电极移动的现象。
蛋白质及氨基酸的分析测定
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