10 第十章　蛋白质的测定.doc

第1页：蛋白质定量法与凯氏定氮法原理

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，由 C、H、O、N、S 五种元素组成。蛋白质溶液是典型的胶体分散系，是具有光学活性的两性物质。

食品中蛋白质的含量分布不平衡：一般植物组织的含量低于动物组织。植物中蛋白质含量一般为 0.5—3%（鲜重），果实中一般为 0.4—1.5%（鲜重），黄豆中可达 40%；动物肌肉及内脏中含量较多，如牛肉 20.1%、乳粉 26.2%。

蛋白质的定量是基于测定总有机氮。某些物质含有大量非蛋白氮化合物（如马铃薯等），须把蛋白质提出来，分别测总氮及非蛋白氮即得到纯蛋白氮。蛋白质的量一般按总氮量乘上一个合适的换算系数求得，该系数取决于物质中蛋白质的含氮量——蛋白质含氮量一般为 15—17.6%，如为 16% 则换算系数为 6.25（鸡蛋、青豆、肉、玉米等）。

蛋白质定量法

• 物理方法：折射率、比重、紫外吸收等方法，操作简便。
• 化学方法：凯氏定氮法、杜马法、双缩脲法、福林（Folin）—酚试剂法、染料结合法。
• 定氮法、双缩脲法、物理法是利用蛋白质共性（含氮量、肽键、折射率等）的方法；其他方法是利用蛋白质特定氨基酸残基（芳香基、酸性基团、碱性基团等）的方法。

凯氏定氮法

最准确和操作最简单的方法之一，可同时测定多个样品，是法定的标准检验方法。

杜马法

多半用于有机分析，很少用于食品分析。

双缩脲反应法

在碱性环境中双缩脲与 CuSO₄ 结合生成红紫色络合物；双缩脲法和酚试剂法是生物领域科学研究经常使用的方法。

染料结合法

正在急速发展的新方法。

半微量凯氏定氮法（微量、常量凯氏定氮法）

原理与过程：消化—蒸馏—吸收与滴定。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化使蛋白质分解，分解的氨与硫酸生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨分离，用硼酸吸收后再用标准硫酸或盐酸滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数即为蛋白质含量。

• 消化：含氮有机化合物经浓 H₂SO₄ 加热消化，硫酸使有机物脱水、炭化生成碳，碳将 H₂SO₄ 还原为 SO₂ 并变为 CO₂；SO₂ 使氮还原为 NH₃ 并氧化为 SO₃，NH₃ 与硫酸结合成 (NH₄)₂SO₄。
• 蒸馏：(NH₄)₂SO₄ 在碱性条件下释放出氨。
• 吸收与滴定：放出的氨可用一定量的标准硫酸溶液吸收，用标准 NaOH 反滴定过量的 H₂SO₄（或用硼酸溶液吸收后再用标准 HCl 或 H₂SO₄ 直接滴定），从而计算总氮量并推算蛋白质含量。

反应式（蛋白质以氨基丙酸计）：2CH₃CHNH₂COOH + 13H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄ + 6CO₂ + 12SO₂ + 16H₂O；(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH → 2NH₃ + 2H₂O + Na₂SO₄；NH₄HB₄O₇ + HCl + 5H₂O → NH₄Cl + 4H₃BO₃。

第2页：消化条件、操作步骤与计算

样品的分解条件：消化过程中为加速分解常加入下列物质。

具体操作步骤

• 消化：精密称取固体样品 0.2—2 g、半固态 2—5 g 或液体样品 10—20 mL 于凯氏烧瓶（30—50 mL），加入无水 K₂SO₄ 2 g、CuSO₄ 0.2 g、H₂SO₄ 20 mL；烧瓶成 45° 倾斜，先小火加热待泡沫停止后加大火（330—400℃），直到溶液澄清透明为止（3—4 h）；冷却后加水定容，数次冲洗使溶液全部注入容量瓶。
• 蒸馏：将 2% 硼酸溶液 10 mL 放入 100 mL 三角瓶中，加甲基红混合指示剂 5 滴，冷凝管尖端浸入液面下；将凯氏烧瓶内容物移入蒸馏瓶，加 40% NaOH 10 mL 加热蒸馏，至硼酸液由酒红色变为蓝绿色时继续蒸馏 5 分钟，将冷凝管尖端提出液面并冲洗尖端。
• 滴定：馏出液用 0.01 N 标准 HCl 溶液滴定，直到蓝绿色变为灰紫色，并将滴定结果用空白试验校正。
• 计算：蛋白质（%）= (V₁ − V₂) × N × 0.014 × 6.25 ÷ W × 100。V₁ 为样品滴定时用去 0.01 mol 标准 HCl 液的毫升数，V₂ 为空白滴定时用去的毫升数，N 为标准 HCl 溶液的当量浓度，0.014 为 1 mL 1 mol HCl 相当于 0.014 g 氮，6.25 为氮换算为蛋白质的系数，W 为样品克数。

常量凯氏定氮法：消化原理与步骤和半微量凯氏定氮法基本一致，所不同的是样品量和试剂用量不同，另有一套适合于常量测定的仪器装置。

第3页：常量凯氏定氮法与其他测定方法

常量凯氏定氮法（续）：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸溶液吸收，再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸溶液，这样便可计算出总氮量，进而推算蛋白质含量。

含硝食品的测定：一般生物材料中亚硝酸盐含量很少，但有的样品硝酸盐含量较大，例如菠菜、萝卜、胡萝卜等蔬菜（根部尤其）和西瓜、甜瓜、草莓等水果（特别是外果和皮部），其硝酸盐含量有时可高达 1000 ppm。以硝酸盐、亚硝酸盐形式存在的氮在凯氏法消化时会成为硝酸和亚硝酸挥发损失，因此需特殊操作：加入水杨酸使硝态氮变成硝基水杨酸固定下来，加入硫代硫酸钠使其还原为氨基化合物，在浓硫酸作用下分解，最后变成硫酸铵，然后按凯氏法定氮。

染料结合法：来源相同的蛋白质，其碱性（或酸性）氨基酸含量大体相同。利用这一特点加入过量的酸性（或碱性）染料，使其与蛋白质形成不溶性盐而沉淀析出；用分光光度计测定未反应的染料量，再根据算出的结合染料量求出蛋白质含量。

其他方法

• 双缩脲法：双缩脲在碱性环境中能与硫酸铜结合成红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应；蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构相似，故能呈此反应。
• 紫外线吸收光谱法：直接测定芳香族氨基酸对紫外线的吸收光谱（酪氨酸和色氨酸的最大吸收为 280 纳米）及肽键对紫外线的吸收光谱（肽键最大吸收为 190 纳米）来定量蛋白质。该方法首先用于测定牛乳中的蛋白质含量，也可用于小麦面粉、豆类、蛋黄及肉制品。
• 酚试剂法：来自酚试剂（磷钼酸、磷钨酸的混合液）和蛋白质中芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸）的呈色反应与双缩脲反应的复合方法。