第1页：半微量凯氏定氮法（标准方法）
教学目标：掌握蛋白质及蛋白质消化的概念与知识；了解蛋白质测定的原理与方法，熟练掌握常量凯氏定氮法，掌握样品消化、蒸馏、吸收的操作技能。
蛋白质是生命的物质基础，是构成人体及动植物细胞组织的重要成分之一，在体内有构成新生组织、修补组织及制造酶和激素等生命基础物质的作用。食品中蛋白质含量不仅表示食品质量，也关系人体健康。
标准方法（GB 5009.5—85）半微量凯氏定氮法
- 原理
- 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵；然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数即为蛋白质含量。
试剂（所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制）
- 硫酸铜（CuSO4·5H2O）
- 硫酸钾
- 硫酸
- 硼酸溶液（20 g/L）
- 混合指示液：1 份 1 g/L 甲基红乙醇溶液与 5 份 1 g/L 溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合；也可用 2 份 1 g/L 甲基红乙醇溶液与 1 份 1 g/L 次甲基蓝乙醇溶液临用时混合
- 氢氧化钠溶液（400 g/L）
- 标准滴定溶液：硫酸标准溶液 [c(1/2H2SO4) = 0.0500 mol/L] 或盐酸标准溶液 [c(HCl) = 0.0500 mol/L]
仪器：定氮蒸馏装置，包括电炉、水蒸气发生器（2 L 平底烧瓶）、螺旋夹、小玻杯及棒状玻塞、反应室、反应室外层、橡皮管及螺旋夹、冷凝管、蒸馏液接收瓶。
操作方法（样品处理与消化）
- 精密称取 0.02—2.00 g 固体样品、2.00—5.00 g 半固体样品或吸取 10.00—20.00 mL 液体样品（约相当于氮 30—40 mg），移入干燥的 100 mL 或 500 mL 定氮瓶中。
- 加入 0.2 g 硫酸铜、3 g 硫酸钾及 20 mL 硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45° 斜支于有小孔的石棉网上。
- 小心加热，待内容物全部炭化、泡沫完全停止后加强火力，保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后再继续加热 0.5 h。
- 取下放冷，小心加 20 mL 水，放冷后移入 100 mL 容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶，再加水至刻度混匀备用；同时做试剂空白试验。
操作方法（蒸馏与滴定）
- 按图装好定氮装置，水蒸气发生瓶内装水至约三分之二处，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠防暴沸，加热煮沸。
- 向接收瓶内加入 10 mL 20 g/L 硼酸溶液及混合指示剂 1—2 滴，冷凝管下端插入液面下；吸取 10.0 mL 样品消化稀释液由小漏斗流入反应室，以 10 mL 水洗涤小烧杯使流入反应室，塞紧棒状玻塞。
- 将 10 mL 400 g/L 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓慢流入反应室，立即盖紧并加水于小烧杯中防漏气，夹紧螺旋夹开始蒸馏 5 min。
- 移动接收瓶使冷凝管下端离开液面，再蒸馏 1 min，用少量水冲洗冷凝管下端外部；以硫酸或盐酸标准溶液（0.05 mol/L）滴定至灰色或蓝紫色为终点；同时准确吸取 10 mL 试剂空白消化液按同样操作。
第2页：蛋白质计算与氮换算系数
计算：X = (V1 − V2) × c × 0.014 × F ÷ m × 100
- X — 样品中蛋白质的含量，g/100g（g/100 mL）
- V1 — 样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL
- V2 — 试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL
- c — 硫酸或盐酸标准溶液的浓度，mol/L
- 0.014 — 1.00 mL 硫酸 [c(1/2H2SO4) = 1.000 mol/L] 或盐酸 [c(HCl) = 1.000 mol/L] 标准溶液中相当的氮的质量，g
- m — 样品的质量（或体积），g 或 mL
- F — 氮换算为蛋白质的系数
氮换算为蛋白质的系数对照表| 样品类别 | 换算系数 F |
|---|
| 一般食物 | 6.25 |
|---|
| 乳制品 | 6.38 |
|---|
| 面粉 | 5.70 |
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| 玉米、高粱 | 6.24 |
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| 花生 | 5.46 |
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| 米 | 5.95 |
|---|
| 大豆及其制品 | 5.71 |
|---|
| 肉与肉制品 | 6.25 |
|---|
| 大麦、小米、燕麦、裸麦 | 5.83 |
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| 芝麻、向日葵 | 5.30 |
|---|
说明：源文本在“大麦、小米”一组中另列有“蒸麦”，与“燕麦”疑为重复，本表按通用表述合并列出，该组系数 5.83 未作改动。
说明
- 凯氏定氮法测定的是氮的含量，再依据蛋白质中含氮量换算为蛋白质含量。
- 消化过程中加入硫酸钾可提高反应温度，加入硫酸铜作催化剂可提高反应速度。
- 蒸馏过程中不能使系统漏气，放入碱液时应小心、缓慢。
- 食品中含氮量一般为 15%—17.6%，上表系数为含氮量 16% 时的换算值。
- 食品中还有非蛋白质含氮物质，故此法测得的蛋白质称为粗蛋白。
- 蒸馏时蒸汽要充足均匀，加碱要够量、动作要快，防止氨损失；冷凝管出口应浸入吸收液中。
- 我国规定含乳饮料中蛋白质 ≥1.0%。
参考方法：全量凯氏定氮法
- 原理与半微量法相同，只是样品量和试剂用量不同，另有一套适合于常量测定的仪器装置。
- 试剂：硫酸铜、硫酸钾、硫酸、混合指示液、氢氧化钠溶液（400 g/L）、硼酸溶液（20 g/L）、硫酸或盐酸标准滴定溶液（0.0500 mol/L）。
- 仪器（凯氏定氮装置）：500 mL 定氮瓶、定氮蒸馏球、节流夹、漏斗、冷凝管、接收瓶。
第3页：全量凯氏定氮法的操作与计算
全量凯氏定氮法的操作方法
- 精密称取 0.20—2.00 g 固体样品或 2—5 g 半固体样品，或吸取 10—20 mL 液体样品（相当于氮 30—40 mg），小心移入已干燥的 500 mL 定氮瓶中。
- 加入 0.5 g 硫酸铜、10 g 硫酸钾及 20 mL 硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45° 斜支于有小圆孔的石棉网上。
- 小心加热，待内容物全部炭化、泡沫完全停止后加强火力，保持瓶内液体沸腾（微沸），至液体呈蓝色澄清透明后再继续加热 0.5 h；放冷，小心加入 200 mL 水，再放冷。
- 连接已准备好的蒸馏装置，塞紧瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面下；接收瓶内盛有硼酸溶液 50 mL（20 g/L）及混合指示液 2—3 滴。
- 放松节流夹，通过漏斗倒入 70—80 mL 氢氧化钠溶液（400 g/L），振摇定氮瓶至内容物转为深蓝色或产生褐色沉淀，再倒入 100 mL 水，夹紧节流夹加热蒸馏至氨被完全蒸出。
- 停止加热前先将接收瓶放下少许，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏 1 min，然后停止加热，用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。
- 以硫酸或盐酸标准溶液（0.0500 mol/L）滴定至灰色为终点，同时做试剂空白试验。
计算：X = (V1 − V2) × c × 0.014 × F ÷ m × 100，各符号含义与半微量凯氏定氮法相同。
说明：本法为直接蒸馏法，蒸馏终点的确定对测定结果准确度影响很大；一般样品馏出液超过 250 mL 时氮可完全蒸出，蒸馏时注意勿烧干。
