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第1页：凯氏定氮法原理与消化

实验三 肉与肉制品中蛋白质含量的测定（凯氏定氮法）

一、原理

在凯氏定氮过程中，样品中的蛋白质和其他有机成分在催化剂存在下被硫酸消化，总有机氮转化成硫酸铵，然后碱化蒸馏，中和消化液使氨游离，并将氨蒸馏至硼酸溶液中形成硼酸铵，用标准酸溶液滴定，测出样品转化后的氮含量。由于非蛋白组分中也含有氮，所以此方法的分析结果为样品中的粗蛋白含量。

二、试剂

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

硫酸铜

消化过程中加入以增加反应速度，起催化剂的作用

硫酸钾

与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度（纯硫酸沸点330℃，添加硫酸钾后可达400℃），加速反应过程

硫酸

消化剂

2%硼酸溶液

吸收蒸馏出的氨

混合指示剂

1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合；也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基兰乙醇溶液临用时混合

0.05N硫酸或盐酸标准溶液

滴定吸收液用

三、仪器

凯氏定氮蒸馏装置、分析天平、凯氏烧瓶、酸式滴定管、容量瓶（100mL）、量筒（100mL）、20mL吸管、托盘天平、10mL吸管、三角烧瓶。

图1 凯氏蒸馏装置：装置由蒸汽发生器、安全管、导管、汽水分离器、样品入口、反应管、冷凝管、冷凝水与接收三角瓶等部分构成（各部件名称见原课件图1标注）。

四、操作方法

1．样品处理

精密称取0.2～2.0g固体样品、2～5g半固体样品或吸取10～20mL液体样品（含氮量5～80mg），准确至0.0002g；肉及肉制品取样量为0.8～1.2g。移入干燥的100mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、3g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化、泡沫完全停止后加强火力（360～410℃），并保持瓶内液体微沸至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20mL水，放冷后移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

第2页：蒸馏滴定与粗蛋白计算

2．装置

按图装好凯氏定氮蒸馏装置，在水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性。加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

3．半微量蒸馏

向锥形瓶内加入10mL 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端浸入液面下。准确移取样品消化液10mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，立即将夹子夹紧；再加10mL氢氧化钠溶液，小心松动夹子使之流入反应室，将夹子夹紧，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏5min后降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。取下接收瓶，滴定至终点。

4．滴定

蒸馏后的吸收液立即用0.05mol/L硫酸或0.05mol/L盐酸标准溶液（邻苯二甲酸氢钾法标定）滴定，溶液由蓝绿色变成灰色或灰红色为终点。同时吸取10mL空白液按上述方法蒸馏。

5．计算

粗蛋白质（%）=（v₂ − v₁）× c × 0.0140 × 6.25 /［m ×（V′/V）］× 100

v₂

滴定样品时所需标准酸溶液体积，mL

v₁

滴定空白样品时所需标准酸溶液体积，mL

c

盐酸标准溶液浓度，mol/L

m

试样质量，g

V

试样消化液总体积，mL

V′

试样消化液蒸馏用体积，mL

0.0140

与1.00mL盐酸标准溶液（1.000mol/L）相当的、以克表示的氮的质量

6.25

氮换算成蛋白质的平均系数；蛋白质中氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25

不同食品的氮换算系数：肉与肉制品为6.25，乳制品为6.38，小麦粉为5.70，玉米、高粱为6.24，大豆及其制品为5.71。

6．重复性要求

• 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。
• 粗蛋白质含量在25％以上时，允许相对偏差为1％。
• 粗蛋白质含量在10％～25％之间时，允许相对偏差为2％。
• 粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。

五、凯氏定氮法的优缺点

优点

• 可用于所有食品的蛋白质分析中；
• 操作相对比较简单；
• 实验费用较低；
• 结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；
• 用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。

缺点

• 最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮；

说明：原文氮换算系数中的「白粉」按上下文订正为「小麦粉」；计算式按原文符号含义整理为标准分式写法。

第3页：凯氏定氮法的缺点（续）

缺点（续）

• 实验时间太长（至少需要2h才能完成）；
• 精度差，精度低于双缩脲法；
• 所用试剂有腐蚀性。

说明：本页为上一页「凯氏定氮法的缺点」条目的续页，源文件分页后此处仅剩第②～④项，正文较短。