07 实验七 肉与肉制品中聚磷酸盐含量的测定.doc

第1页：薄层分析法与提取

实验七 肉与肉制品中聚磷酸盐含量的测定

一、薄层分析法

（一）测定原理

用三氯乙酸提取肉和肉制品的聚磷酸盐，提取液经乙醇、乙醚处理后，用微晶纤维素薄层层析板分离，通过喷雾显色检验聚磷酸盐。

（二）仪器和材料

• 实验室常规仪器
• 绞肉机，孔径不超过4mm
• 实验室用匀浆器
• 涂0.25mm厚板的涂布器
• 玻璃板：10×20cm²、5×20cm²
• 层析缸、微量注射器
• 吹风机：有冷、热风挡
• 喷雾器

（三）试剂

所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或相当纯度的水。三氯乙酸、乙醚、95％乙醇。

薄层板

用薄层用微晶纤维素制备，或用同样的预制板；可溶性淀粉

标准参比混合液

在100mL水中溶解：磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）200mg、焦磷酸四钠（Na₄P₂O₇·10H₂O）300mg、三磷酸五钠（Na₅P₃O₁₀）200mg、六偏磷酸钠(NaPO₃)x（x＞10）200mg

展开剂

将异丙醇140mL、浓度为135g/L的三氯乙酸水溶液40mL、氢氧化铵0.6mL混合均匀，放入密闭瓶中

显色剂Ⅰ

将同体积的浓硝酸与浓度为75g/L的四水钼酸铵溶液混合，在100mL上述溶液中溶解酒石酸10g（现用现配）

显色剂Ⅱ

在浓度为150g/L焦亚硫酸钠溶液195mL与浓度为200g/L亚硫酸钠溶液5mL的混合液中溶解1-氨基-2-萘-4-磺酸0.5g，再溶解结晶乙酸钠40g；贮于密闭棕色瓶中，冰箱保存，可存放一周

（四）操作方法与步骤

1．取样

至少取有代表性的试样200g，于绞肉机中至少绞两次使其均质化并混匀，贮于密闭容器中备用；尽快分析试样，不得超过5h。

2．薄层板的制备

将可溶性淀粉0.3g溶解在90mL沸水中，冷却后加入微晶纤维素粉15g，用匀浆器均化1min。用涂布器把浆液涂在玻璃板上，铺成0.25mm厚的浆层，在室温下自然干燥1h，再在100℃烘箱中加热10min，取出立即放入干燥器中。也可以使用预制的微晶纤维素板。

3．提取聚磷酸盐

将40～60℃的水15mL倒入装有50g试样的烧杯中，搅拌不超过5min。加入三氯乙酸10g，彻底搅匀，迅速放入冰箱冷却1h后取出，用扇形滤纸过滤。若滤液混浊，加入同体积的乙醚摇动一次，用吸管吸出醚弃去，水相中加入同体积的乙醇振摇1min，静置几分钟，用扇形滤纸过滤。

4．薄层层析分离

将适量展开剂倒入层析缸中，使深度为5～10mm，盖上盖避光静置30min。用微量注射器取提取液3μL（经澄清处理的取6μL），点在距板底边约2cm处的薄层板上，尽量使点的直径很小，用吹风机的冷风档吹干。

第2页：层析显色与Rf值对照

注：避免热风，防止磷酸盐水解。用同法将标准参比液3μL点在同一块板上，距样品点1～1.5cm，距板底距离与样品点一致。打开层析缸盖，迅速而小心地把点过样的薄层板放入缸中，盖上盖，避光在室温下展开。展开到溶剂前沿上升约10cm处，取出薄层板，放进烘箱中干燥10min（也可在室温下干燥30min或用吹风机冷风档吹干）。

5．磷酸盐的检验

展开过的薄层板立在通风橱中，用喷雾器把显色剂Ⅰ均匀地喷到板上，出现黄斑。用吹风机吹干薄层板，放进100℃烘箱至少烘1h，把硝酸全部除去。薄层板冷却至室温，再放入通风橱中喷显色剂Ⅱ，出现明显的蓝斑。

注：不是绝对要喷显色剂Ⅱ，但此显色剂产生强烈的蓝斑可提高检测效果。同一试样进行两次检验。

（五）结果的表示

将试样的斑点与磷酸盐标准参比混合液斑点移动距离相比较。标准参比混合液磷酸盐的Rf值见下表。

一般在肉和肉制品中提取磷酸盐的Rf值偏低。

注：可用鲜肉的提取液校正磷酸盐的Rf值，鲜肉中只含正磷酸盐。

二、化学分析法

（一）原理

测定磷酸盐时，先将不完全干燥的样品灰化，然后使磷酸盐水解为正盐，再以磷钼酸喹啉形式离析出来。首先将磷酸盐生成磷钼酸（有柠檬酸盐存在时），然后磷钼酸再与碱、喹啉形成磷钼酸喹啉；柠檬酸能与铵离子结合，阻止磷钼酸铵沉淀的出现。后来使用丙酮使溶液合二为一，即用一种试剂作为沉淀剂，称为喹铝柠酮试剂，由混合物中的铝酸盐、柠檬酸盐和丙酮的英文名字字头命名。

（二）仪器

• 古氏坩埚（coors 4号，可用布氏漏斗代替）
• 玻璃纤维滤纸（圆周2.4cm）：将备有玻璃纤维滤纸的古氏坩埚装在抽滤装置上，把滤纸放在板中央，用50mL左右水洗涤，在通风烘箱内于125℃下干燥30min，移入干燥器内冷却称重
• 坩埚、烘箱、马福炉、500mL烧杯、100mL量筒、抽滤装置、干燥器

（三）试剂

稀硝酸：加1体积浓硝酸于4体积水中。

第3页：化学分析法步骤与校正因数

（三）试剂（续）

喹铝柠酮试剂

在150mL水中溶解70g二水合钼酸钠；在85mL硝酸和150mL水的混合液中溶解60g柠檬酸并冷却，边搅拌边缓缓将钼酸钠溶液倒入柠檬酸—硝酸溶液中；溶解5mL合成喹啉于35mL浓硝酸和100mL水的混合液中，不时搅拌，缓缓加到钼酸—硝酸溶液中，混合均匀，放置24h后过滤；向滤液中加280mL丙酮，用水稀释至1L，混合后存于无色聚乙烯瓶或深棕色玻璃瓶中。

（四）实验步骤

1. 准确称取2.5g样品（样品中P₂O₅含量不超过25mg），置于用于灰化的坩埚中，在通风烘箱内于125℃下干燥30min，再在550℃下灰化至成为白色或接近白色为止。
2. 冷却，向灰化坩埚中加入25mL稀硝酸，在蒸汽浴中加热30min，过滤，收集滤液于400mL烧杯中，用蒸馏水清洗灰化坩埚和滤纸，使收集的滤液总体积为100mL左右。从这一步开始用25mL稀硝酸和75mL蒸馏水做试剂空白平行试验。加50mL喹铝柠酮试剂于盛滤液的烧杯中，盖上表面皿并煮沸1min（不要用明火），悉心搅拌并冷却至室温。
3. 将沉淀移入与抽滤装置相连的古氏坩埚内，分别用25mL蒸馏水洗涤5次，每次洗涤水彻底排干后再加下一部分水。
4. 在125℃下使古氏坩埚和锅内收集物干燥30min，移入干燥器中冷却，称重。

（五）计算

磷含量（%）=［（A − B）× 0.014 − 0.0106］/ C × 100

A

样品沉淀物的重量

B

空白测定物重量

C

样品重量

0.014

重量换算因数，由30.97（磷的原子量）/2212.7（磷钼酸喹啉分子量）得来

0.0106

肉蛋白质中天然磷含量的校正因数

说明：原文换算因数写作「2212.7（磷钼酸喹啉分子量）/30.97（磷的原子量）」，与0.014的数值不符，应为30.97/2212.7；另「00106」按上下文订正为「0.0106」。

下表为磷换算为磷酸盐的校正因数。

说明：原文三聚磷酸钠化学式作「Na₅PO₁₀」，按标准化学式订正为「Na₅P₃O₁₀」。