09 实验七 蛋白质含量的测定.doc

第1页：蛋白质测定原理与氮换算系数

蛋白质组成与性质复杂，食品分析中通常以总氮量表示，再乘以换算系数计算蛋白质含量。一般食品（肉、蛋、豌豆、玉米等）蛋白质含氮量约 10%，换算系数为 6.25。

凯氏定氮反应：

1. 2NH2(CH2)2COOH + 13H2SO4 → (NH4)2SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O
2. (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH3 + 2H2O + Na2SO4
3. 2NH3 + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 5H2O
4. (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3

第2页：试剂、仪器与样品消化

试剂与仪器：硫酸钾、硫酸铜、硫酸、2% 硼酸溶液、40% 氢氧化钠溶液；混合指示剂由 0.1% 溴甲酚绿乙醇溶液 10 毫升与 0.1% 甲基红乙醇溶液 2 毫升混合而成；0.01N 盐酸或 0.01N 硫酸标准溶液；凯氏微量定氮仪一套、定氮瓶、三角瓶、量筒、吸量管、酸式滴定管、100 毫升容量瓶、小漏斗。

样品消化：精密称取 0.2-2.0 g 固体样品、2-5 g 半固体样品或吸取 10-20 ml 液体样品（约相当于氮 30-40 mg），移入干燥的 100 ml 或 500 ml 定氮瓶中，加入 0.2 g 硫酸铜、3 g 硫酸钾及 20 毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以 45 度角斜支于有小孔的石棉网上。小火加热至内容物全部炭化、泡沫完全停止后加强火力，保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后再继续加热 0.5 小时。取下放冷，小心加 20 ml 水，放冷后移入 100 ml 容量瓶，洗液并入后加水至刻度混匀备用。取相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

第3页：蒸馏吸收、滴定与计算

蒸馏装置：水蒸气发生器内装水约 2/3，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸保持酸性，加数粒玻璃珠防暴沸，加热煮沸。

蒸馏与滴定：接收瓶内加 10 ml 2% 硼酸溶液及混合指示剂 1 滴，冷凝管下端插入液面下；吸取 10.0 ml 样品消化液由小玻璃杯流入反应室，以 10 ml 水洗涤小烧杯并入，塞紧棒状玻璃塞；将 10 ml 40% 氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即塞紧并加水于小杯防漏气。夹紧螺旋夹开始蒸馏 5 min，移动接收瓶使冷凝管下端离开液面再蒸馏 1 min，用水冲洗冷凝管下端外部；取下接收瓶，以 0.01N 硫酸或盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时取 10.0 ml 试剂空白消化液同法操作。

计算：X = (V1 - V2) × N × 0.014 / [m × (10/100)] × F × 100。其中 X 为样品中蛋白质的含量（g/100g），V1 为样品消耗标准酸体积（ml），V2 为试剂空白消耗体积（ml），N 为标准酸当量浓度，0.014 为 1N 标准酸 1 ml 相当于氮的克数，m 为样品质量（g），F 为氮换算为蛋白质的系数。

第4页：凯氏定氮法注意事项

• 样品应均匀，固体预先研细混匀，液体振摇或搅拌均匀。
• 样品放入定氮瓶时不要沾附瓶颈，万一沾附可用少量水冲下，以免消化不完全使结果偏低。
• 消化不易呈透明溶液时，可将定氮瓶放冷后慢慢加入 30% 过氧化氢 2-3 ml 促使氧化；全程不宜用强火，保持和缓沸腾并使火力集中于瓶底，以免附壁蛋白质在无硫酸存在下损失氮。
• 硫酸不足时过多的硫酸钾会形成硫酸氢钾而不与氨作用，引起氨损失；硫酸消耗过多或样品脂肪含量高时应增加硫酸量。
• 硫酸钾用于提高溶液沸点，硫酸铜为催化剂，并在蒸馏时作碱性反应指示剂。
• 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色、中性呈灰色、酸性呈红色；无溴甲酚绿时可单独使用 0.1% 甲基红乙醇溶液。
• 氨是否蒸馏完全可用 pH 试纸试馏出液是否呈碱性；吸收液也可用 0.01N 酸代替硼酸，过剩酸以 0.01N 碱滴定。
• 以硼酸为吸收液可省去标定碱液的操作，且硼酸体积要求不严格，可免去移液管。
• 加浓碱时出现褐色沉淀，是碱与硫酸铜生成氢氧化铜受热分解为氧化铜所致；铜离子与氨作用可生成深蓝色络合物。