第1页：实验一 微生物染色
实验一 微生物染色：本实验围绕微生物染色展开，先讲清染色原理，再训练一般染色法与革兰氏染色法两套操作。
- 实验目的
- 染色原理
- 染色方法
- 实验材料
- 实验内容与步骤
- 注意事项
- 实验结果
第2页：实验一目的
一、实验目的
学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。
第3页：染色原理
二、染色原理
微生物细胞含大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，机体无色透明、与背景反差小，普通光学显微镜下不易识别，必须经染色使菌体与背景形成明显色差，才能清楚观察其形态和结构。
- 两性电解质性质
- 微生物细胞由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成，兼有碱性基和酸性基：在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电；在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。
- 等电点与染料结合
- 细菌等电点 pH 在 2～5 之间，在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌等电点均低于溶液 pH，细菌带负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合，故常用碱性染料染色。
- 分结构着色
- 微生物体内各结构与染料的结合力不同，可用不同染料分别染各结构以便观察。
第4页：简单染色法
三、染色方法
- （一）简单染色法
- 又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色。如果仅为在显微镜下看清细菌形态，用简单染色即可。
第5页：复染色法与革兰氏染色
（二）复染色法
用两种或多种染料染细菌，目的是鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法，主要有革兰氏染色法和抗酸性染色法。
- 革兰氏染色法
- 不仅能观察细菌形态，还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌（G+）；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌（G-）。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由其细胞壁成分和结构不同造成的。
- 革兰氏阳性细菌 G+：呈蓝紫色
- 革兰氏阴性细菌 G-：呈红色
第6页：实验一材料与菌种
四、实验材料
- 器材：显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。
- 染液与试剂：石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃红染液。
- 菌种：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌。
第7页：简单染色步骤：涂片与干燥
五、实验内容与步骤
（一）细菌的简单染色步骤：涂片 → 干燥 → 固定 → 染色 → 水洗 → 干燥 → 镜检
- 涂片：取干净载玻片，中央滴一滴无菌蒸馏水；接种环火焰上烧红、冷却后挑取少量菌种（金黄色葡萄球菌或枯草杆菌），与水滴混匀后涂布成均匀薄层，涂布面不宜过大。
- 干燥：最好室温下自然干燥；如需加快，可标本面向上，手持载玻片一端两侧在酒精灯高处微微加热使水分蒸发，切勿紧靠火焰或加热过久，以防标本烤枯变形。
第8页：固定、染色、水洗与干燥
（一）细菌的简单染色步骤（续）
- 固定：手持载玻片一端、标本向上，在酒精灯火焰外层快速来回通过 2～3 次，共约 2～3 秒，并不时以载玻片背面触及皮肤，以不觉过烫为宜（不超过 60 ℃），放置待冷后染色。
- 染色：在涂片薄膜上滴加染色液（石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种）一滴，使染液覆盖涂片，染色约 1 min。
- 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
- 干燥：用吸水纸吸去涂片边缘水珠，置室温下自然干燥；用吸水纸时切勿将菌体擦掉。
第9页：革兰氏染色步骤（一）
7．镜检：用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。
（二）细菌的革兰氏染色步骤：涂片 → 干燥 → 固定 → 初染 → 水洗 → 媒染 → 水洗 → 脱色 → 水洗 → 复染 → 水洗 → 干燥 → 观察
- 取大肠杆菌和枯草杆菌（均无菌操作）分别做涂片、干燥、固定，方法与简单染色相同。
- 用草酸铵结晶紫染色 1 min 后水洗。
- 加碘液媒染 1 min 后水洗。
- 斜置载玻片，滴加 95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需 20～30 s，随即水洗。
第10页：革兰氏染色复染与镜检
（二）细菌的革兰氏染色步骤（续）
- 用蕃红染液复染 1 min，水洗。
- 用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色；绘出细菌形态图并说明革兰氏染色的结果。
第11页：实验一注意事项
六、注意事项
- 革兰氏染色成败的关键是脱色时间：脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而误认为阴性菌；脱色时间过短，革兰氏阴性菌会被误认为阳性菌，因此必须严格把握脱色时间。
- 宜选用培养 18～24 小时菌龄的细菌；细菌太老时，菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
第12页：实验结果记录表
思考题及实验作业
- 不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？
- 通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？
七、实验结果：简单染色中金黄色葡萄球菌和枯草杆菌染成（ ）色；革兰氏染色（大肠杆菌与枯草杆菌）结果填入下表。
实验一染色结果记录表| 菌种 | 简单染色结果 | 革兰氏染色结果 |
|---|
| 金黄色葡萄球菌 | 待填写 | — |
|---|
| 枯草杆菌 | 待填写 | 待填写 |
|---|
| 大肠杆菌 | — | 待填写 |
|---|
第13页：
第14页：
第15页：
第16页：
第17页：
