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第1页：实验二 酵母菌大小的测定和细胞计数

实验二 酵母菌大小的测定和细胞计数

一、实验目的

学会测微尺和血球计数板的使用方法；建立对微生物大小的概念。

二、实验材料

1. 显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数板、载玻片等。
2. 麦芽汁培养基、酵母菌。
3. 吸管、吸水纸等。

第2页：酵母菌大小测定原理

三、实验原理

（一）酵母菌大小的测定原理

微生物大小需用刻有一定刻度的测微尺测量：先用具有绝对长度的物镜测微尺校正不表示绝对长度的目镜测微尺，计算后者每格所代表的实际长度；再放上待测标本，用目镜测微尺测定微生物细胞所占格数，即可计算出该微生物的大小。酵母菌的直径约 8～10 μm。

第3页：酵母细胞计数原理

（二）酵母细胞计数原理：微生物常用计数方法有两种。

直接计数法

利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。

间接计数法

在平板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。

本实验利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品作适当稀释，按规定方法及计算公式运算后即可得出实际数值。

第4页：测微尺的构造

四、操作方法

（一）酵母菌大小测定的操作方法

1. 目镜测微尺的构造

目镜测微尺是一块圆形玻片，中央刻有精确刻度，通常将 5 mm 划分为 50 格，实际每格等于 100 μm。刻度大小随接目镜和接物镜放大倍数而改变，用前必须用物镜测微尺标定。

2. 物镜测微尺的构造

物镜测微尺是一块特制载玻片，中央有一小圆圈，圆圈内刻有分度，将长 1 mm 的直线等分为 100 小格，每小格等于 10 μm。

第5页：目镜测微尺的标定

2. 目镜测微尺的标定

1. 取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放入接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜并装入镜筒内。
2. 将物镜测微尺置于显微镜载物台上，使有刻度的一面朝上，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。
3. 先用低倍镜观察，对准焦距，看清物镜测微尺刻度后转动目镜，使目镜测微尺刻度与物镜测微尺刻度平行，并使两尺左边第一条线重合，再向右寻找两尺的另一条重合线。
4. 记录两条重合线间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。

第6页：每格长度的计算方式

3. 计算方式

目镜测微尺每格长度 = 两个重叠刻度间物镜测微尺格数 × 10 ÷ 两个重叠刻度间目镜测微尺格数

• 以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度：目镜测微尺（　）格 = 物镜测微尺（　）格，目镜测微尺每格 =（　）。
• 如此测定的目镜测微尺尺度，仅适用于测定时所用显微镜的目镜和物镜放大倍数；若更换物镜、目镜放大倍数，必须重新校正标定。

第7页：酵母菌大小的测定

4. 酵母菌大小的测定

1. 取下物镜测微尺，换上酵母菌水浸制片。
2. 测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格，然后换算出菌体的实际长度。
3. 在同一标本上测定 5～10 个菌体，求其平均值。

第8页：血球计数板的构造

（二）酵母细胞数的测定操作方法

1. 血球计数板的构造：血球计数板由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成，玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台；中间平台较宽，又被一短横槽隔为两半，每半边上面各刻有一个方格网。方格网上刻有 9 个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格的长和宽各为 1 mm，深度为 0.1 mm，其体积为 0.1 mm³。

数据修正：源文件此处作「长和宽各为 1m，深度为（缺）」，按血球计数板标准规格应为长宽各 1 mm、深度 0.1 mm、容积 0.1 mm³。

第9页：计数室规格与样品稀释

两种规格的共同点：每一大方格都由 16×25 = 25×16 = 400 个小方格组成。

2. 血球计数板的使用

1. 用血球计数板计数酵母菌悬液中的酵母菌个数。
2. 样品稀释的目的是便于计数，以每小方格内含 4～5 个酵母细胞为宜，一般稀释 10 倍即可。

第10页：血球计数板的使用步骤

2. 血球计数板的使用（续）

3. 将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。
4. 用吸管吸取一滴稀释后的酵母菌悬液，置于盖玻片边缘，使菌液缓缓渗入；多余菌液用吸水纸吸取，稍待片刻，使酵母菌全部沉降到计数室内。
5. 计数时，若使用 16 格 × 25 格规格，按对角线位取左上、右上、左下、右下 4 个中格（即 100 个小格）的酵母菌数；若为 25 格 × 16 格规格，除取 4 个对角方位外，还需再数中央的一个中格（即 80 个小方格）。

第11页：压线细胞计数与重复计数

2. 血球计数板的使用（续）

6. 遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格上方和右方线上的酵母细胞（或只计数下方和左方线上的细胞）。
7. 对每个样品计数三次，取其平均值，按公式计算每 1 ml 菌液中所含的酵母菌个数。

第12页：酵母菌计数计算公式

3. 计算公式

16 格 × 25 格的血球计数板

酵母细胞数 / ml = 100 小格内酵母细胞个数 ÷ 100 × 400 × 10⁴ × 稀释倍数

25 格 × 16 格的血球计数板

酵母细胞数 / ml = 80 小格内酵母细胞个数 ÷ 80 × 400 × 10⁴ × 稀释倍数

数据修正：源文件公式中的「104」按计数板换算关系应为 10⁴（10 的 4 次方）。

第13页：血球计数板的清洁

4. 血球计数板的清洁

• 使用后先用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷；洗后自行晾干或用吹风机吹干，也可用 95％乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。
• 通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物；若不干净，必须重复清洗直到干净为止。

第14页：实验结果记录表

五、思考题及实验作业

1. 若更换不同放大倍数的目镜和物镜时，必须用物镜测微尺标定目镜测微尺，这是为什么？
2. 利用血球计数板时，注入的菌液为什么不能过多？
3. 测定酵母细胞大小的结果。

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