07 第七章 分光光度法.ppt

第1页：第7章分光光度法

分光光度法

基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光光度法和红外光谱法等。

第2页：吸光光度法的特点

• （一）灵敏度高：测定浓度下限一般可达 10⁻³% 的微量组分，对固体试样一般可测到 10⁻⁴%；预先富集还可再提高 1～2 个数量级。
• （二）准确度较高：一般相对误差为 2%～5%，虽不如滴定分析法与重量法，但对微量成分已比较满意。
• （三）操作简便，测定速度快。
• （四）应用广泛：几乎所有无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法测定。

第3页：光的基本性质与物质的颜色

• 光是电磁波，通常用波长、频率来描述。
• 可见光：人眼能看见有颜色的光，波长范围大约为 400～760 nm。
• 白光（日光、白炽灯光、日光灯等）由各种不同颜色的光按一定强度比例混合而成，经三棱镜分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七色，称为光的色散。
• 只具有一种颜色的光称为单色光，白光称为复合光。

第4页：互补色与固体物质的颜色

• 互补色：两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合可成为白光，这两种单色光互为互补色，如绿光与紫光互补、蓝光与黄光互补。
• 固体颜色：完全吸收呈黑色，完全反射呈白色，各波长吸收程度相近呈灰色。
• 物质选择性吸收某些波长的光时，其颜色由所反射或透过光的颜色决定。

第5页：溶液的颜色与吸收光谱曲线

• 溶液呈现不同颜色，是由于溶液中的质点（分子或离子）选择性吸收某种颜色的光所引起。
• 溶液呈现的颜色与它所吸收的光成互补色：如硫酸铜溶液吸收黄色光而呈蓝色，高锰酸钾溶液吸收绿色光而呈紫色。
• 吸收光谱曲线：将不同波长的单色光依次通过一定浓度的溶液，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标绘制的曲线，描述溶液对不同波长光的吸收情况。

第6页：透光率和吸光度

光强关系

I₀ = Iₐ + Iₜ，I₀ 为入射光强度，Iₐ 为溶液吸收光强度，Iₜ 为透射光强度。

透光率 T

T = Iₜ / I₀ × 100%。

吸光度 A

A = lg(I₀ / Iₜ) = lg(1 / T) = －lg T。

第7页：朗伯-比尔定律

朗伯－比尔定律

一束平行单色光通过均匀、无散射的溶液时，在光强、温度等条件不变的情况下，溶液吸光度与溶液浓度及液层厚度的乘积成正比，即 A = K c L。

该定律不仅适用于有色溶液，也适用于无色溶液以及气体和固体的非散射均匀体系；不仅适用于可见光区，也适用于紫外和红外光区的单色光。

第8页：吸光系数

摩尔吸光系数 ε

波长一定时，溶液浓度为 1 mol·L⁻¹、液层厚度为 1 cm 的吸光度，单位为 L·mol⁻¹·cm⁻¹，ε = A / (c L)。

比吸光系数 α

波长一定时，溶液浓度为 g·L⁻¹、液层厚度为 1 cm 的吸光度，单位为 L·g⁻¹·cm⁻¹，α = A / (c L)。

二者换算：ε = α M，M 为摩尔质量。

第9页：吸收光谱与最大吸收波长

吸收光谱

在浓度一定的条件下，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标绘制的曲线，又称吸收光谱曲线。

最大吸收波长

曲线上吸光度最大处称为最大吸收峰，所对应的波长称为最大吸收波长，用 λmax 表示。

实际工作中通常选择最大吸收波长作为测定波长，以获得最高的灵敏度。

第10页：单组分的定量：标准曲线法

• 取与被测物质含相同组分的标准品，配成一系列浓度不同的标准溶液，置于相同厚度吸收池中分别测其吸光度。
• 以浓度 c 为横坐标、吸光度 A 为纵坐标绘制 A－c 曲线，符合比尔定律时为通过原点的一条直线，即标准曲线。
• 在相同条件下测出样品溶液的吸光度，即可从标准曲线上查出对应的样品浓度。

第11页：单组分的定量：对照法

对照法（比较法）

相同条件下配制样品溶液与标准溶液，在选定波长处分别测吸光度；同种物质、同台仪器、相同厚度吸收池与同一波长下 K 与 L 相同，故 c样 = A样 / A标 × c标。

为减少误差，比较法配制的标准溶液浓度常与样品溶液浓度相接近。

测定不纯样品中某纯品含量时，可先配制相同浓度的不纯样品溶液与标准品溶液，在最大吸收峰处分别测定吸光度 A 值，直接计算样品含量。

第12页：多组分的定量

根据吸光度的加和性，可以在同一试样中不经分离同时测定两个以上的组分。

第13页：多组分吸收曲线的互不干扰与相互干扰

• （a）A、B 组分互不干扰：可分别在各自最大吸收波长处测定吸光度，直接求出各自含量。
• （b）A、B 组分彼此干扰：在两个波长处分别测定两组分的总吸光度 A₁ 与 A₂，再根据吸光度的加和性列出联立方程求解。

第14页：吸光度的测量原理与测定步骤

分光光度计实际测得的是光电流或电压，通过转换器将测得的电流或电压转换为对应的吸光度 A；测定时只要将待测物质推入光路，即可直接读出吸光度值。

• 1．调节检测器零点，即仪器的机械零点。
• 2．用不含待测组分的参比溶液调节吸光零点。
• 3．测定待测组分的吸光度。

第15页：吸光光度法的仪器：光源与单色器

吸光光度法的仪器一般由光源、单色器（分光系统）、吸收池、检测系统和信号显示系统五部分组成。

• （一）光源：常用 6～12 V 低压钨丝灯，由稳压器供电以保持光源强度稳定。
• （二）单色器（分光系统）：从光源发出的复合光中分出所需单色光，通常由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦镜和出射狭缝组成。

第16页：吸收池与检测系统

• （三）吸收池（比色皿）：用透明无色的光学玻璃制作，多为长方形，也有圆柱形，一般厚度为 0.5、1、2、3 cm。
• （四）检测系统（光电转换器）：光度计中常用硒光电池，对 500～600 nm 光线最灵敏，不能用于紫外和红外区。
• 光电管和光电倍增管用于较精密的分光光度计，具有灵敏度高、光敏范围广、不易疲劳等特点。

第17页：信号显示系统与检流计刻度

• （五）信号显示系统：早期用检流计、微安表、电位计、数字电压表、自动记录仪等；现代分光光度计广泛采用数字电压表、函数记录仪、示波器及数据处理台。
• 悬镜式检流计（直流复射式检流计）灵敏度可达 10⁻⁹ 安培/格，使用中要防止震动或大电流通过。
• 检流计标尺有两种刻度：等刻度表示百分透光率 T%，对数刻度表示吸光度 A。

第18页：邻二氮菲比色法测定水样中铁的含量

实验：邻二氮菲比色法测定水样中铁的含量

第19页：邻二氮菲测铁的实验目的

• 1、学会使用 721 型分光光度计，了解和掌握分光光度法测定原理。
• 2、学会邻二氮菲法测定试样中微量铁含量的原理及方法。
• 3、了解分光光度计的构造及使用。
• 4、学会标准曲线的方法。

第20页：邻二氮菲测铁的实验原理

邻二氮菲是测定微量铁的一种较好试剂，在 pH = 2.0～9.0 的条件下，Fe²⁺ 与邻二氮菲生成很稳定的橙红色络合物。

第21页：配合比、还原剂与干扰离子

• 配合物的配合比为 3∶1；Fe³⁺ 与邻二氮菲形成蓝色配合物，稳定性较差，故常加入还原剂盐酸羟胺使 Fe³⁺ 还原为 Fe²⁺。
• 还原反应：4Fe³⁺ + 2NH₂OH ═ 4Fe²⁺ + N₂O + H₂O + 4H⁺。
• 测定时控制溶液酸度在 pH 2～9 较适宜：酸度过高反应速度慢，酸度太低则 Fe²⁺ 水解影响显色。
• Bi³⁺、Ca²⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Zn²⁺ 与显色剂生成沉淀，Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺ 形成有色络合物，共存时应注意其干扰。

第22页：测铁实验的仪器与铁标准溶液配制

仪器

721（722）型分光光度计、50 mL 容量瓶 8 个、10 mL 与 5 mL 刻度移液管各 1 支、5 mL 量筒、500 mL 烧杯、洗瓶、洗耳球、小滤纸、镜头纸。

铁标准溶液（100 μg·mL⁻¹）

准确称取 0.8634 g 铁盐 NH₄Fe(SO₄)₂·12H₂O，加 20 mL 6 mol·L⁻¹ HCl 和少量水溶解，定量转移入 1 L 容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀。

第23页：铁标准溶液的稀释与试剂配制

• 铁标准溶液（10 μg·mL⁻¹）：移取上述标准溶液 10.00 mL 置于 100 mL 容量瓶，加入 6 mol·L⁻¹ HCl 2.0 mL，加水稀释至刻度，摇匀。
• 10% 盐酸羟胺溶液（新配制）。
• 0.1% 邻二氮菲溶液（新配制）。
• HAc－NaAc 缓冲溶液（pH ≈ 5.0）：称取 136 g NaAc 加水溶解，加入 120 mL 冰醋酸，加水稀释至 500 mL。

第24页：邻二氮菲-Fe2+吸收曲线的绘制

• 吸取铁标准溶液（10 μg·mL⁻¹）0.0、2.0、4.0 mL 分别放入 50 mL 容量瓶，加入 1 mL 10% 盐酸羟胺溶液、2.0 mL 0.1% 邻二氮菲溶液和 5 mL HAc－NaAc 缓冲溶液，加水稀释至刻度，摇匀，放置 5 min。
• 用 3 cm 比色皿，以试剂溶液为参比（0.00 mL 铁标准溶液中加入相同试剂），在 721 型分光光度计上于 420～600 nm 波长范围内测定吸光度。
• 临近最大吸收波长处间隔 5～10 nm 测定，其他各处间隔 20～40 nm；以波长为横坐标、A 为纵坐标绘制吸收曲线，找出最大吸收峰波长 λmax。

第25页：标准曲线的绘制与试样分析

• 标准曲线的绘制：吸取铁标准溶液（10 μg·mL⁻¹）0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 分别放入 7 支 50 mL 容量瓶，依次加入 1 mL 10% 盐酸羟胺溶液、2.0 mL 0.1% 邻二氮菲溶液和 5 mL HAc－NaAc 缓冲溶液，稀释至刻度摇匀，放置 5 min。
• 用 3 cm 比色皿，以不加铁标准溶液者为参比，选 λmax 为测定波长测 A 值，以铁含量为横坐标、A 为纵坐标绘制标准曲线。
• 水样分析：取 3 支 50 mL 容量瓶，各加入 5.00 mL 未知试样溶液（铁含量以落在标准曲线范围内为宜），同法显色后于 λmax 处用 3 cm 比色皿平行测定 A 值，取平均值，从标准曲线上查出铁的质量并计算水样中铁的含量。

第26页：邻二氮菲测铁的思考题

• 1、邻二氮菲分光光度法测定铁时，为何加入盐酸羟胺溶液？
• 2、邻二氮菲与铁的显色反应，其主要条件有哪些？
• 3、简述 722 型分光光度计的主要结构，测量时应注意什么？

第27页：植物中可溶性还原糖的测定

实验：植物中可溶性还原糖的测定

第28页：还原糖测定的目的要求

• 1. 学会用 3，5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性还原糖的含量。
• 2. 学会 721 型分光光度计的使用。

第29页：还原糖测定的仪器与试剂

仪器

分析天平、721 型分光光度计、比色皿、大试管、水浴锅、纱布或滤纸、100 mL 容量瓶、小烧杯、剪刀或研钵、比色管、移液管（1 mL、2 mL）、25 mL 量筒、坐标纸。

试剂

3，5-二硝基水杨酸（DNS 试剂）、葡萄糖（105 ℃ 干燥至恒重，分析纯）、辣椒或黄瓜。

第30页：721型分光光度计的光学系统与反应原理

• 721 型分光光度计采用自准式光路、单光束结构，波长范围为 360～800 nm，用钨丝白炽灯泡作光源（12 V 25 W）。
• 光学系统组成：光源灯、聚光透镜、色散棱镜、准直镜、保护玻璃、狭缝、反射镜、吸收池、光门板、光电管。

第31页：DNS法测还原糖的原理

3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与棕红色的深浅成正比，可用比色法测定糖的含量。本法操作简便、快速，杂质干扰较小。

第32页：葡萄糖标准溶液配制与样品提取

• 1. 葡萄糖标准溶液配制：准确称取 105 ℃ 干燥至恒重的葡萄糖 0.1000 g，溶于水后定容至 100 mL，摇匀备用。
• 2. 样品中可溶性还原糖的提取：准确称取 1.9000～2.0000 g 新鲜辣椒（或 4.9000～5.0000 g 黄瓜）1 份，剪碎或研碎放入大试管，加水 20 mL，沸水浴加热提取 20 min，冷却后过滤入 100 mL 容量瓶，水洗残渣 2～3 次，定容至刻度备用。

第33页：标准曲线的制定

• 1. 取 7 支比色管编号，按下表加入试剂，由浓到稀配制标准系列溶液，各管混匀。
• 2. 以第一管为空白，在 520 nm 波长下测定吸光度。
• 3. 以葡萄糖含量为横坐标、吸光度 A 为纵坐标绘制标准曲线，查得样品液中还原糖的含量。

第34页：实验结果与数据记录表

数据记录：下表列出标准管与样品管的加液方案。

说明：样品管列（样品液 1.0 mL、蒸馏水 1.0 mL、DNS 试剂 1.0 mL、另加蒸馏水 2 mL）在源文件中数据粘连，未能安全切分，此处仅还原标准管部分，建议对照原图补充。

结果计算：还原糖 % = （由标准曲线查得的还原糖量 ÷ 样品质量）× 100%。

第35页：还原糖测定的注意事项

• 1. 比色皿洗净后用所盛溶液润洗 3 次。
• 2. 用擦镜纸轻轻擦干净比色皿的外表。
• 3. 测吸光度时由稀到浓溶液依次测定。
• 4. 读出三位有效数字。
• 5. 测量完毕及时切断电源，比色皿用蒸馏水洗干净，登记使用情况并盖好防护罩。