页数：148页文件大小：6.41 MB来源： 生物化学ppt课件
本课件围绕蛋白质展开：先讲蛋白质的生物功能与元素组成，再系统讲解氨基酸的通式、分类、酸碱性与茚三酮、桑格、Edman 等反应；随后进入肽键与一级结构测定、酰胺平面、α-螺旋与β-折叠、超二级结构与结构域、三级结构与分子伴侣；最后说明镰刀型贫血、细胞色素 C、胰岛素等构效关系实例以及蛋白质的胶体性质、变性与分离纯化。
一、蛋白质的生物功能及组成二、蛋白质的基本组成单位——氨基酸三、蛋白质的结构四、蛋白质的结构与功能的关系五、蛋白质的重要性质第二章蛋白质
蛋白质的生物功能有机体代谢的催化剂有机体内的结构组分运输载体运动的完成者激素调节有机体的免疫机能贮藏功能毒素信号传递遗传信息表达的调节
蛋白质的化学（元素）组成
| 元素 | 含量 |
|---|---|
| C | 50%–55% |
| N | 15%–18% |
| H | 6%–8% |
| O | 6%–8% |
| S | 0%–4% |
| 其它 | P、Fe、Mn、Zn、Mo 等 |
蛋白质的基本组成单位——氨基酸（Amino Acid，AA或aa）CCOOHRHNH2R或αCCOOHNH3+αAA的通式：
由于AA有不对称的Cα（甘氨酸除外）的存在使得AA有L和D（R或S）型之分，天然的AA均为L型；同时有旋光性的存在。AA的构型和吸光性
根据R的性质(一)AA的分类极性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸见P24
Asp和Asn二者常混在一起用Asx表示；Glu和Gln二者常混在一起用Glx表示。请注意：
注意AA各C原子的编号HCOOHNHC2CH2CH2CH2CH22H Nεαβγδε氨基
芳香族AA—Tyr, Trp, Phe可以吸收280nm的紫外光, 据此可对蛋白质进行定量和定性(二)AA的吸光性
带电性pIpK`pI和pK`的关系(三)AA的酸碱性
| 氨基酸 | pK′1（—COOH） | pK′2（—NH2） | pK′R | pI |
|---|---|---|---|---|
| Gly | 2.34 | 9.60 | — | 5.97 |
| Asp | 2.09 | 9.82 | 3.86 | 2.97 |
| Lys | 2.18 | 9.17 | 10.34 | 9.74 |
尽管AA具有酸碱性但却不能用正常的酸碱滴定进行测定(因为酸和碱基团的相互干扰, 使等当点的pH过高或过低,没有适当的指示剂可以选用)。AA不能用通常酸碱滴定测定？
AA+甲醛则可以掩盖氨基，使AA成为普通的酸CCOOHRHNH2+2HCHOCCOOHRHN(CH-OH)22可进行正常的酸碱滴定
(三)AA的重要化学反应
1.茚三酮反应AA+茚三酮 缩合物(紫色)Pro 和羟Pro 为黄色1.此反应复杂,产物为混合物;2.此反应灵敏,是鉴定AA的常用方法;3.短肽也有此反应,但肽链越长灵敏度越差。
2.桑格(Sanger)反应
DNP-AA
3. Edman反应
PTH-AA
三、蛋白质的结构
蛋白质结构的层次性一级结构（AA序列）二级结构超二级结构结构域三级结构（球蛋白）四级结构（聚合体）
蛋白质的一级结构AA序列与共价键结构1. 肽键及肽
AA残基
蛋白质的骨架
肽链的方向
肽链的命名P31
有关肽的说法2个AA组成的肽称为二肽, 依次类推少于10个AA称为寡肽多于10个AA称为多肽100个AA以上称为蛋白质
肽的作用C—NH—-CH-C-NH-CH2COOHCH2=—O—=O—SH—COOH—CHNH2—CH2CH2αβγδ—γGlu-Cys-GlySS—γGlu-Cys-Gly︱还原型谷胱甘肽（GSH）氧化型谷胱甘肽（GSSG）2GSHGS-SG-2H+2H二硫键
传统方法
1 先纯化蛋白质。这是一项艰巨而繁重的任务，要测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的，纯度应在97%以上同时必须知道它的相对分子量，误差允许在10%左右。•2测定末端氨基酸的数目。确定蛋白质分子是由几条肽链构成的。（1条：末端摩尔数=蛋白质的摩尔数；若检测到的末端基多于一种，蛋白质是由两条或多条不同的肽链组成）
3拆分蛋白质分子的多肽链，并分离出每条肽链。如果待测蛋白质由几条肽链组成，并且链间靠非共价键连接，用变性剂如8M 尿素或高浓度盐等处理，使拆分；若靠二硫键连接，那么就需要用氧化剂或还原剂断裂二硫键分离，普遍用的是过量的巯基乙醇处理，可以使S-S定量还原为SH，同时系统中需要加入8M尿素等，使蛋白变性，这样还原剂才能作用于S-S，然后用烷基化试剂如碘乙酸保护还原时生成的SH，防止重新被氧化。并根据他们的大小或电荷的不同分离出各多肽
4分析每一条肽链的氨基酸组成。将分离纯化的多肽链一部分样品完全水解，测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。
5至少用两种方法将肽链水解成小的肽段酶裂解法化学裂解法•6 肽段氨基酸序列的测定Edman化学降解法
7通过比较（片段重叠法）确定多肽链的氨基酸顺序。•8确定二硫键位置：用电泳法将拆开二硫键的肽段条带与未拆开二硫键的条带进行对比即可定位二硫键的位置。如此以来，一个完整蛋白质分子的一级结构即可被测定。
质谱方法•质谱方法的改进，使测序容易起来。
The Nobel Prize in Chemistry 2002•"for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules"
matrix-assistedlaser desorption/ionization mass spectrometry,or MALDI MS
DNA序列推导法•DNA测序后来居上，方法简单快速。
3.蛋白质一级结构的举例
(二) 蛋白质的二级结构1.构型与构象构型 立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。构象 化合物中σ 键的自由旋转，使连接在σ 键两端原子上的原子或基团在空间上形成的不同的排列方式。蛋白质的空间结构则是由构象不同造成的。
2. 酰胺平面肽键的双键性质C—N 0.149nmC=N 0.127nmC—N肽键0.132nm, 有部分双键性质
CCNOHC
3. 二级结构的基本类型σ-螺旋
σ-螺旋的要点在φ=-57°，ψ=-48°时所形成的规则构象。1.在α-螺旋中，3.6个AA上升一周,螺旋上升一圈,沿纵轴距离为0.54nm, 每个残基旋转100°, 升高0.15nm, 螺旋以右手为主。
2. α-螺旋的稳定性是靠链内H键维持的。螺旋每隔3个AA 残基可以形成一个氢键,即每个肽键上的N-H氢和它后面(C端)第4个残基上C=O氧之间形成H 键.氢键的取向几乎与中心轴平行。
-N-(CO-CHR-NH)3-C-H O链内的氢键
3. 肽链中AA残基的R基团分布在螺旋体的外侧,R基团的大小、形状及电荷均影响到了α-螺旋的形成。
β-折叠(片)
β-折叠结构中肽链处于伸展状态, 两个AA残基之间的距离为0.36nm。肽链按层排列,靠链间氢键维持其结构的稳定性。相邻肽链走向可以是平行的(φ=-119°，ψ=+113°)，也可以是反平行的(φ=-139°，ψ=+135°)。肽链中的AA残基的R基团分布在片层的上下。β-折叠的要点
σ-螺旋与β-折叠比较σ-螺旋β-折叠棒状片状肽链紧紧盘绕肽链几乎完全展开链内氢键链间氢键AA间距0.15nm 0.36nm R螺旋的外部R在片层的上下如角蛋白如丝蛋白
β-转角
无规则线圈
β bugle（凸起）is also found in proteins
二级结构的类型α-螺旋β-折叠β-转角无规则线圈β bugle（凸起）
超二级结构αα βαβ βββ
Two arrangements of βstrands stabilized by the tendency of the strands to twist
Constructing large motifsfrom smaller ones
结构域在空间结构上相对独立的三维实体
蛋白质的折叠Folding of proteins蛋白质的三级结构Tertiary Structure
蛋白质如何知道折叠？怎样折叠？How Do Proteins Know How to Fold?This question is extremely complicated and not yet clearly understood by now. But there are some highlights. 经典实验－核糖核酸酶的变性与复性实验Classical Experiment－Christian Anfinsen’s experiments demonstrated that proteins can fold reversibly.
形成二硫键的可能性The possibilities of disulfidebondsFirst 7Second 5Third 3Fouth 1Total 7X5X3=105因此正确二硫键形成的概率为1/105
肽键的顺反异构Isomers of transand cis of peptide bonds
每层7个GroEL 分子两层构成桶状1个GroES 分子构成一个盖子play
the prion disease(madcow disease, PrPmisfolding)A stained section of the cerebral cortex from apatient shows spongiform degeneration错误折叠将导致死亡！Death by misfolding！
Tagged by ubiquitin and generated polyubiquitin.
The 20S proteasome consists of four stacked rings each containing 7 subunits.play
The Nobel Prize in Chemistry 2004
铁卟啉环是由四个吡咯环和四个甲烯基组成
四级结构的意义避免出错节约DNA变构调节
五、蛋白质结构与功能的关系
（一）一级结构与功能的关系一级结构中包含着全部的功能信息，可以直接决定功能，也可以通过影响构象而影响其功能。
由于β链上可以形成粘斑，血红蛋白聚集成线状，使红细胞撑挤成镰刀状。从而危及到生命。
可变AA—反映了的生物多样性不变AA—保证了正常功能的实现
（二）蛋白质构象与功能的关系核糖核酸酶变构效应离子吸收
五、蛋白质的重要性质
带电原因缓冲作用等电点沉淀电泳技术（一）蛋白质的酸碱性和等电点
分子在1-100nm之间属于胶体溶液。具有胶体溶液的一切性质，如：布朗运动、光散射现象、渗透压、粘度等（二）蛋白质的胶体性质
透析盐析与盐溶有机溶剂沉淀重金属沉淀生物碱沉淀
Dialysis –Separation based on size
Gel-Filtration Chromatography –Separation based on size
在离心力的作用下，当重力作用大于扩散作用时，蛋白质胶体就会沉降，沉降的快慢用沉降系数表示。蛋白质的沉降
沉降系数一般在1×10-13到200×10-13之间，将10-13作为一个单位，用S表示（S是纪念瑞典科学家Svedberg, 单位是秒）。因此，一般蛋白质的分子大小在1S-200S之间。数据越大分子量越大。注意：转速（v）与离心力（g）的关系离心机使用的常识：平衡、低速到高速
胶凝与胶溶凝胶溶胶胶溶作用胶凝作用凝胶会肿胀（吸浆）和收缩（离浆）
变性——蛋白质由有序的紧密结合状态到无序散漫状态的变化。变性可分为可逆的和不可逆的。变性剂——能够使蛋白质变性的物质。通常用的杀菌方法。（二）蛋白质的变性
（三）蛋白质的分离和纯化•纯化的一般原则：破碎（机械、渗透、冻融、超声波、酶法）抽提（缓冲液、表面活性剂、低温）获得粗制品（等电点、盐析、有机溶剂沉淀）
蛋白质的分离提纯
（四）蛋白质的呈色反应
（五）蛋白质分子量测定凝胶过滤SDS－PAGE （六）蛋白质的定量测定紫外吸收福林酚法考马斯亮蓝G-250定氮法（七）蛋白质纯度鉴定PAGE
本章结束
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