08 第八章 蛋白质和氨基酸的测定.ppt

第1页：蛋白质和氨基酸测定学习目标

蛋白质和氨基酸测定——学习目标

• 了解蛋白质和氨基酸的性质
• 明确蛋白质和氨基酸测定方法
• 掌握凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注意事项
• 了解氨基酸的性质和测定方法

第2页：蛋白质和氨基酸测定内容

蛋白质和氨基酸测定内容

• 1. 概述
• 2. 凯氏定氮法
• 3. 蛋白质的快速测定法
• 4. 氨基酸总量的测定
• 5. 氨基酸的分离与测定

第3页：蛋白质和氨基酸测定概述

1. 概述

• 蛋白质的生理功用及在食品中的作用
• 食品中的蛋白质含量
• 蛋白质系数
• 蛋白质水解
• 蛋白质测定方法
• 氨基酸的测定与分离方法

第4页：凯氏定氮法原理

2. 凯氏定氮法

原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用 H₃BO₃ 吸收后再以标准 HCl 溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。

第5页：蛋白质测定的过程与试剂

第6页：

第7页：消化反应方程式

消化

2NH₂(CH₂)₂COOH + 13H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄ + 6CO₂ + 12SO₂ + 16H₂O

一定要用浓硫酸（98%）。

第8页：蒸馏与吸收

蒸馏与吸收：消化液 + 40% 氢氧化钠 → 加热蒸馏，放出氨气，用硼酸溶液吸收。

第9页：滴定与计算

滴定：用盐酸标准溶液滴定至终点，然后根据标准酸消耗量进行计算。

第10页：微量凯氏定氮装置

微量凯氏定氮装置：本页展示微量凯氏定氮装置的组成与连接方式，包括消化管、水蒸气发生、碱液加入与冷凝吸收部分。

第11页：蛋白质测定仪：消化、蒸馏吸收

蛋白质测定仪：本页展示蛋白质测定仪完成消化、蒸馏与吸收的部件结构。

第12页：蛋白质测定仪：滴定

蛋白质测定仪——滴定：本页展示蛋白质测定仪的自动滴定部分与终点判定方式。

第13页：KDN型蛋白质测定仪

KDN 型蛋白质测定仪：本页展示 KDN 型蛋白质测定仪的外观与操作面板。

第14页：QSY-Ⅱ型蛋白质测定仪

QSY-Ⅱ 型蛋白质测定仪：本页展示 QSY-Ⅱ 型蛋白质测定仪的外观与结构组成。

第15页：蛋白质的快速测定法

3. 蛋白质的快速测定法：传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不需要大型仪器，但费时间，有环境污染。新开发的方法有双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等。以下介绍双缩脲法。

第16页：双缩脲法原理

双缩脲法原理

• 脲（尿素）NH₂—CO—NH₂ 加热至 150～160 ℃ 时，两分子缩合成双缩脲；双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，称为双缩脲反应（缩二脲反应）。
• 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH—，与双缩脲结构相似，在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计测定吸光度（560 nm）确定含量。

第17页：双缩脲法的特点与应用

方法特点及应用范围：本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法；亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。

第18页：氨基酸总量的测定方法

4. 氨基酸总量的测定

• （一）甲醛滴定法
• （二）茚三酮的比色法

第19页：甲醛滴定法原理

（一）甲醛滴定法

原理

氨基酸本身有碱性 —NH₂— 基，又有酸性 —COOH 基，成中性内盐；加入甲醛溶液后，甲醛与 —NH₂— 结合，碱性消失，再用强碱来滴定 —COOH 基。

第20页：甲醛滴定法的适用范围与试剂

适用范围：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量、发酵过程中氮量减少情况及食品中游离氨基酸的测定等。

试剂

• 40% 中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将 40% 甲醛中和至蓝色
• 0.1% 百里酚酞乙醇溶液
• 0.1% 中性红 50% 乙醇溶液
• 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液

第21页：甲醛滴定法的操作

操作：同时取两份试样。一份加中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴定，中和样液中其他酸性物质；另一份加百里酚酞与中性甲醛，用 NaOH 滴定，中和样液中氨基酸的羧基与其他酸性物质的总和。二者之差即可计算氨基酸含量。

第22页：茚三酮比色法

（二）茚三酮的比色法

原理

氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。

第23页：氨基酸的分离与测定方法

5. 氨基酸的分离与测定

• （一）薄层色谱法
• （二）氨基酸自动分析仪法
• （三）气相色谱法
• （四）高效液相色谱法

第24页：薄层色谱法原理

（一）薄层色谱法

原理

取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的 Rf 值，不同成分则有不同的 Rf 值，因而各种混合物可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸对比鉴别种类，从显色斑点颜色的深浅可大致确定其含量。

第25页：Rf值的计算

Rf 值：Rf ＝ a／b，其中 a 为点样原点到样点中心的距离，b 为点样原点到溶剂前沿的距离。

第26页：薄层色谱的操作方法

操作方法

• ① 薄层板制备
• ② 样品液制备
• ③ 点样
• ④ 展开
• ⑤ 显色

第27页：氨基酸自动分析仪法

（二）氨基酸自动分析仪法：使用氨基酸自动分析仪，经离子交换柱分离与茚三酮柱后衍生，自动完成氨基酸的定性与定量分析。

第28页：

第29页：气相色谱法

（三）气相色谱法：氨基酸经衍生化提高挥发性后，用气相色谱柱分离并检测，实现多种氨基酸的定量分析。

第30页：高效液相色谱法

（四）高效液相色谱法：氨基酸经柱前或柱后衍生化后，用高效液相色谱分离，以紫外或荧光检测器定量。

第31页：

第32页：本章小结

本章小结

• 重、难点及适用范围：凯氏定氮法测定蛋白质的过程及注意事项
• 了解仪器法测定蛋白质及氨基酸的方法
• 下次课做实验——实验要求
• 作业