12 第九章 微生物的遗传与变异.ppt

第1页：第八章内容导览

• 第一节 遗传变异的物质基础
• 第二节 微生物的基因组结构
• 第三节 质粒和转座因子
• 第四节 基因突变及修复
• 第五节 基因重组
• 第六节 微生物育种
• 第七节 菌种的衰退、复壮与保藏

第2页：遗传与变异的概念

遗传

亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能。

变异

生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体中以极低的几率（10⁻⁵~10⁻⁶）出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。

遗传型（genotype）

一个生物体所含有的基因的总和。

表型（phenotype）

一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。

饰变（modification）

生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平；几乎整个群体中每个个体都发生同样变化，性状变化幅度小、不遗传，引起饰变的因素消失后表型即可恢复。

例如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的红色素在 25 ℃ 和 37 ℃ 下的变化。

第3页：研究微生物遗传的意义：生物学特性

• 个体的体制极其简单
• 营养体一般都是单倍体
• 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖
• 繁殖速度快
• 易于积累不同的中间代谢产物或终产物
• 菌落形态特征的可见性和多样性
• 环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性
• 易于形成营养缺陷型
• 各种微生物一般都有相应的病毒
• 存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式

第4页：研究微生物遗传的意义

• 微生物是研究现代遗传学和其他许多主要生物学基本理论问题中最热衷的研究对象
• 对微生物遗传规律的深入研究促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，并为育种工作提供了丰富的理论基础
• 促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交

第5页：遗传变异物质基础的探索历程

• 种质连续理论：1883~1889 年间 Weissmann 提出，认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物
• 基因学说：二十世纪初发现染色体并提出基因学说，使遗传物质基础的范围缩小到染色体上
• DNA 是遗传变异物质基础的证明：1944 年以后利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）

第6页：格里菲斯经典转化实验

• 研究对象：肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae）
• S 型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜
• R 型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜

1928 年 Griffith 的动物实验：

• 注射活 R 菌或死 S 菌——小鼠存活
• 注射活 S 菌——小鼠死亡
• 注射活 R 菌和热死 S 菌——小鼠死亡，抽取心血分离出活的 S 菌

第7页：转化实验的细菌培养与抽提液验证

细菌培养实验：

• 热死 S 菌——不生长
• 活 R 菌——长出 R 菌
• 热死 S 菌 ＋ 活 R 菌——长出大量 R 菌和少量 S 菌（10⁻⁶）

无细胞抽提液试验：

• 活 R 菌 ＋ S 菌无细胞抽提液——长出大量 R 菌和少量 S 菌

以上实验说明：加热杀死的 S 型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入 R 型细胞并使 R 型细胞获得稳定的遗传性状。

第8页：艾弗里离体转化试验

1944 年 O. T. Avery、C. M. MacLeod 和 M. McCarty 在离体条件下进行的转化试验：

• ① 加 S 菌 DNA
• ② 加 S 菌 DNA 及 DNA 酶以外的酶
• ③ 加 S 菌的 DNA 和 DNA 酶
• ④ 加 S 菌的 RNA
• ⑤ 加 S 菌的蛋白质
• ⑥ 加 S 菌的荚膜多糖

• 只有加 S 菌 DNA 的两组长出 S 菌，其余各组只有 R 菌

只有 S 型细菌的 DNA 才能将肺炎双球菌的 R 型转化为 S 型，且 DNA 纯度越高转化效率也越高，说明 S 型菌株转移给 R 型菌株的是遗传因子。

第9页：噬菌体感染实验

A. D. Hershey 和 M. Chase 于 1952 年的实验结果：

• 含 ³²P-DNA 的一组：放射性 85% 在沉淀中
• 含 ³⁵S-蛋白质的一组：放射性 75% 在上清液中

所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。

第10页：植物病毒的重建实验

为证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含 RNA 的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。

• 将 TMV 在一定浓度的苯酚溶液中振荡，可将蛋白质外壳与 RNA 核心相分离
• 分离后的 RNA 在没有蛋白质包裹的情况下也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子

第11页：杂合病毒的重建与感染结果

将 TMV 与霍氏车前花叶病毒（HRV）拆分后交叉重建形成两种杂合病毒：

• RNA（TMV）＋蛋白质（HRV）
• RNA（HRV）＋蛋白质（TMV）

感染寄主的结果：

• 前者表现 TMV 的典型症状并分离到正常 TMV 粒子
• 后者表现 HRV 的典型症状并分离到正常 HRV 粒子

上述结果说明，在 RNA 病毒中遗传的物质基础也是核酸。

第12页：朊病毒的发现与思考

关于朊病毒的思考：

• 朊病毒含有微量的核酸，仍未发现？
• 朊病毒仅由蛋白质构成
• 朊病毒的遗传物质为蛋白质？

原文作「元病毒」，按通行译名规范为「朊病毒」。

第13页：基因组的概念

基因组

细胞中基因以及非基因的 DNA 序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的 DNA 序列；微生物的基因组一般较小。

第14页：大肠杆菌基因组的特点

• 紧密缠绕的环状双链 DNA 分子
• 遗传信息的连续性
• 功能相关的结构基因组成操纵子结构
• 结构基因的单拷贝及 rRNA 基因的多拷贝
• 基因组的重复序列少而短

第15页：啤酒酵母基因组的特点

• DNA 与组蛋白构成染色体
• 有间隔子或内含子序列
• 没有明显的操纵子结构
• 含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复）

遗传丰余：较高同源性的 DNA 重复序列。

第16页：詹氏甲烷球菌基因组的特点

• 基因组结构类似于细菌：在环形 DNA 分子上功能相关的基因组成操纵子结构，无内含子序列
• 负责信息传递功能的结构（复制、转录和翻译）类似于真核生物，如启动子结构、复制起始因子、RNA 聚合酶、翻译延伸因子等

第17页：第三节 质粒和转座子

本页标题为「第三节 质粒和转座子」，源文件未提取到展开文字，可对照原图补充质粒与转座因子的结构示意。

• 质粒：小型共价闭合环状核外 DNA，能自主复制
• 转座因子：可在染色体与质粒之间移动的 DNA 片段

第18页：原核生物质粒的定义与性质

质粒

一类小型共价闭合环状核外 DNA，能独立于细胞核进行自主复制；可以通过交换掺入细胞核成为附加体，也可以从寄主细胞中消除。近年来也发现了线性双链 DNA 质粒和 RNA 质粒。

• 大小：2~100×10⁶ Da，含有数个到数十个甚至上百个基因
• 严紧型质粒：复制受细胞核控制，一般一个寄主细胞内有 2~3 个
• 松弛型质粒：复制不受细胞核控制，在细胞内的数量可以达到 10~15 个
• 功能：进行细胞间接合并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、降解功能等
• 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生

第19页：质粒的存在范围与制备鉴定

• 存在范围：很多细菌如 E. coli、Shigella、S. aureus、Streptococcus lactis、Agrobacterium tumefaciens 等
• 制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除 RNA 和蛋白质等步骤
• 鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法

第20页：F因子与巨大质粒

F-因子（fertility factor）

致育因子／性因子，62×10⁶ Dalton、94.5 kb，相当于核染色体 DNA 2% 的环状双链 DNA，足以编码 94 个中等大小多肽，其中 1/3 基因（tra 区）与接合作用有关；存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。

巨大质粒（mega 质粒）

近年来在根瘤菌属（Rhizobium）中发现的一种质粒，分子量为 200~300×10⁶ Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，其上有一系列固氮基因。

第21页：Ti质粒的结构与应用

Ti（毒性）质粒（tumor inducing plasmid）

即诱癌质粒，长 200 kb，是一种大型质粒，存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，赋予宿主引起许多双子叶植物根癌的特性。

• 带有 Ti 质粒的细菌侵入植物细胞后，在其细胞中溶解并把细菌 DNA 释放至植物细胞中
• 含有复制子的 Ti 质粒小片段与植物细胞核染色体整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞
• Ti 质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体，可借 DNA 重组技术插入外源基因并整合到植物染色体上，以改变植物的遗传性

第22页：第六节 微生物育种导览

微生物育种的两条主线：

• 自发突变与育种：利用自然发生的突变筛选优良菌株
• 诱变育种：用物理或化学诱变剂处理后再经初筛、复筛获得菌株

第23页：防止菌种衰退的方法

• 控制传代的次数：一般在 DNA 的复制过程中碱基的错配率是 5×10⁻⁴，自发突变的频率为 10⁻⁸~10⁻⁹，采用良好的菌种保藏方法可以减少移种和传代的次数
• 创造良好的培养条件
• 利用不同类型的细胞进行接种传代：对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种
• 采用有效的菌种保藏方法

第24页：菌种的复壮措施

纯种分离：

• 菌落纯的分离方法：平板表面涂布法、平板划线分离法、琼脂培养基浇注法
• 细胞纯的分离方法：用分离小室进行单细胞分离、显微操纵器进行单细胞分离、菌丝尖端切割法进行单细胞分离

• 通过宿主体内生长进行复壮（如苏云金芽孢杆菌的复壮）
• 淘汰已衰退的个体：采用比较激烈的理化条件处理，以杀死生命力较差的已衰退个体

第25页：菌种保藏机构的任务

菌种保藏机构的任务

在广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。

常用的菌种保藏机构：

• 中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）
• 美国的典型菌种保藏中心（ATCC）

第26页：菌种保藏的原理

• 挑选典型菌种的优良纯种，一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）
• 创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）

第27页：菌种保藏方法的分类

生活态——传代培养保藏法：

• 连续在培养基上（内）移种
• 连续在活宿主上（内）移种

休眠态——湿法：

• 固体斜面
• 半固体琼脂柱
• 液体介质（蒸馏水、糖液、其他溶液）

休眠态——干法：

• 藏在玻璃管内
• 吸附在合适的载体上

第28页：干法保藏菌种的方法

藏在玻璃管内的方式：

• 滴入小试管（再放入大试管干燥器中）
• 封入安培瓶
• 菌液直接真空干燥法（L-干燥法）
• 冷冻真空干燥法

吸附在合适载体上的方式：

• 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤＋沙粒）
• 球块状载体（硅胶、瓷球）
• 有机基质（曲料、麦粒）
• 薄片状载体：滤纸片、明胶小片、血清蛋白小片

第29页：常用菌种保藏方法比较表

第30页：核酸存在的七个水平

• 细胞水平：存在于细胞核或核质体
• 细胞核水平：单核或多核结构
• 染色体水平：倍性（真核）和染色体数
• 核酸水平：在原核中同染色体水平，存在部分二倍体；DNA 或 RNA，复合或裸露，双链或单链
• 基因水平：一切具有自主复制能力的遗传功能单位均可称为基因，约 1000 bp，分子量约 6.7×10⁵ Dalton
• 密码子水平：第三位模糊，起始和终止，信息单位
• 核苷酸水平：突变或交换单位

第31页：Col因子的特点与应用

Col 因子（colicinogenic factor）

产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由 E. coli 的某些菌株分泌的细菌素，可通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等专一地杀死其他肠道细菌，都由质粒——Col 因子编码。

Col 因子可分为两类：

• ColE1：分子量小，约为 5×10⁶ Dalton，无接合作用，是多 copy 的
• ColIb：分子量约为 80×10⁶ Dalton，与 F 因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有 1~2 个 copy

凡带 Col 因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用；ColE1 研究得很多，并被广泛用于重组 DNA 的研究和体外复制系统。

第32页：流产转导与普遍转导

流产转导（abortive transduction）

经转导获得了供体菌 DNA 片段的受体菌，如果外源 DNA 在其内仅进行转录、转译和性状表达，这种现象称为流产转导。

普遍转导（generalized transduction）

通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段的误包，而实现其遗传性状传递到受体菌的转导现象。

第33页：转导的概念与方式

转导（transduction）

通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的 DNA 小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象；获得新遗传性状的受体细胞称为转导子（transductant）。

普遍转导：

• 完全普遍转导
• 流产普遍转导

局限转导：

• 低频转导
• 高频转导

第34页：诱变育种的筛选流程

筛选方案：

• 第一轮：诱变剂处理单孢子菌株，选出 200 株初筛（每株 1 瓶），复筛选出 5 株（每株 4 瓶）
• 第二轮：以 5 个出发菌株处理得到 40 株，初筛 40 株选出 50 株，复筛选出 5 株
• 第三轮、第四轮……都同第二轮

以上筛选工作可以连续进行多轮，直至获得良好的结果为止；采用这种筛选方案可以通过较少的工作量获得较好的效果。

第35页：基因工程的概念与应用

基因工程

用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA 大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的 DNA 分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，使供体 DNA 进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

基因工程在食品工业中的应用：

• 工程菌的构建（外源基因的表达、工业发酵用菌种的改造）
• 工业用酶蛋白的改性（第二代基因工程）

第36页：基因工程的基本操作步骤

• 目的基因的取得
• 载体的选择
• 目的基因与载体 DNA 的体外重组
• 重组载体引入受体细胞

第37页：获得目的基因的主要方法

• 从供体细胞的 DNA 中分离（酶切法、PCR 扩增）
• 通过反转录酶的作用由 mRNA 合成 cDNA（拷贝数少的目的基因的获得）
• 由化学方法合成特定功能的基因（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法，合成的长度 150—200 bp，作用：合成基因的元件、合成引物、合成探针、用于基因的定点诱变、作为重组 DNA 连接的构件）

第38页：载体的选择条件与常用载体

载体必须具备的条件：

• 必须是一个复制子
• 在受体细胞中有较高的复制率
• 最好只有一个内切酶切口
• 必须具有选择性遗传标记

目前常用载体：

• 质粒载体
• 噬菌体载体
• 柯斯质粒载体（由噬菌体 DNA 的 COS 序列和质粒复制子构成的特殊类型的质粒载体）

第39页：目的基因与载体的体外连接

核酸内切酶切割：

• 必须使用特定的内切酶（一般为Ⅱ型内切酶）消化目的基因与载体 DNA，使它们产生互补的粘性末端或平末端
• 目的基因与载体 DNA 用同一种内切酶消化即产生相同的粘性末端，在低温（5~6 ℃）下退火时，互补的粘性末端配对重新形成带缺口的双链

DNA 连接酶进行体外连接：

• 粘性末端连接（来源于 E. coli 的 DNA 连接酶）
• 平末端连接（T4 DNA 连接酶）

第40页：重组载体引入受体细胞

受体细胞的种类：

• 微生物细胞（E. coli、B. subtilis、S. cerevisiae）
• 植物细胞
• 动物细胞

重组载体引入受体细胞的方法：

• 转化
• 转染

第41页：基因工程的应用及发展前景

• 基因工程在工业、农业、医疗、环保方面的应用
• 基因工程与基本理论研究的关系