12 液相色谱法1－农药残留测定方法.ppt

第1页：第五章农药残留测定方法

第五章农药残留测定方法

第2页：淋洗液色谱柱检测器数

淋洗液色谱柱检测器数据处理第二节液相色谱仪

第3页：一、GC与HPLC的比较

一、GC与HPLC的比较

第4页：二、流动相的基本要求

二、流动相的基本要求保持色谱柱的稳定性，因而与固定相不互溶（延长柱寿命）不发生不可逆吸附有合适的pH值化学惰性—不与样品及固定相发生反应。

第5页：UV：在紫外线区“透

UV

在紫外线区“透明”示差：折射率与溶剂有较大差异电化学检测器：电惰性。对样品有很强的溶解力。清洗与更换方便低价、毒性小、纯度高。1、适用于所选的检测器

第6页：流动相的选择有合适

2. 流动相的选择有合适的理化性质（沸点、粘度等，尽可能小一些）合适的强度（分配系数要合适，简单样品可大，复杂样品要小）混合溶剂（有等度和梯度之分）极性合适（需根据溶剂的性质而定）

第7页：流动相的物理参数溶解

3、流动相的物理参数溶解度参数（溶剂极性的量度）

• 流动相的物理参数溶解度参数（溶剂极性的量度）：与样品分配比有关，要适中。沸点：要低些，便于回收分离样品。粘度：柱效与粘度成反比，要求早在
• 4～
• 5cP。混合溶剂一般能降低粘度。

第8页：混合溶剂可靠改变

4、混合溶剂可靠改变溶剂组成来调节溶剂的强度等，以适合不容的样品。等度淋洗：淋洗过程中溶剂组成不变，强度恒定，k值在10以内可得较好的分离。梯度淋洗：淋洗过程中溶剂组成随时间而变，一般使强度按程序增加，使组分在最合适的k值处洗出。

第9页：梯度淋洗使用于极性范

5、梯度淋洗使用于极性范围宽的混合物的分离。优点

提供限单位时间内的最大分离度。提高出峰的对称性减小峰宽降低检测

第10页：梯度淋洗的注意事项

问题

要用高纯试剂（贵）。可能在固定相上产生杂质富集，需再生处理（尤其是极性柱），可用10 ～30倍柱体积的溶剂淋洗。5、梯度淋洗

第11页：三、液相色谱柱的保养

三、液相色谱柱的保养柱的稳定性与固定相类型及使用情况有关。为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须进行仔细地保养。是否会由于柱外效应，使分析柱的柱效明显下降？

第12页：（一）防止色谱柱堵塞

（一）防止色谱柱堵塞

• 防止堵塞
• 必须将流动相仔细地蒸馏、过滤。在流动相贮槽与柱之间，使用
• 5μm孔径的过滤器。水往往是一个重要的污染源。在水溶液流动相（如缓冲液）中，细菌容易生长，可能堵塞筛板。防止细菌生长的办法是加入抑制剂，如
• 01%NaNO3。显然，抑制剂不能干扰分离和测定。

第13页：防止堵塞：流量减少的判断

防止堵塞：流量减少的判断

• 防止堵塞
• 在恒定压力下，发现流量减少，柱子可能部分堵塞。堵塞最容易发生在极窄的入口接头处以及入口、出口筛板处。堵塞后需要仔细拆洗，清除堵塞物，但必须防止较强的机械震动，防止用热手接触柱子，以扰动柱内的固定相层，使柱效发生变化。

第14页：要防止反冲（流动相逆向流动）

要防止反冲（流动相逆向流动）

• 要防止反冲（流动相逆向流动），否则使固定相层位移，柱效下降。
• 柱子两端用金属螺帽封闭，保存在纯净的有机溶剂中。应该将柱子保存在以下pH范围内的水溶液流动相中：2<pH<
• 5。为了长期保存，最好用纯有机溶剂（如甲醇）清洗柱子。
• 一定要防止柱子干涸，特别是硬胶柱。
• 防止堵塞

第15页：二、液相色谱柱的保养

二、液相色谱柱的保养8．使用卫柱(Guard Column,亦称预柱)。连续注射含有强滞留(不被洗脱)组分的样品，将使柱效下降，保留值改变，选择性变坏，柱寿命缩短。为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱之间加上卫柱。

第16页：液相色谱柱的保养：卫柱

二、液相色谱柱的保养卫柱较短(5~10cm)，固定相与分析柱类似。其作用是吸着强滞留的组分，防止对分析柱的污染，保持分析柱性能稳定。实验表明，只要卫柱与高效、小粒度分析柱联用，除了使k’为零的组分的塔板数大大减少外，对k’值较大的组分，其柱效下降很少。

第17页：三、检测器

三、检测器

第18页：三、检测器紫外检

三、检测器紫外检测器UV-DETECTOR

第19页：二极管阵列检测器DI

二极管阵列检测器DIODE ARRAY DETECTOR

第20页：四、液相色谱仪的使用

四、液相色谱仪的使用

• 流动相
• 溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。

第21页：3）高纯度

3）高纯度

• 高纯度。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。
• 低粘度。常用的有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。

第22页：溶剂前处理：过滤

必须做! 溶剂前处理过滤

0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。

第23页：目的：除去流动相中溶

目的

除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）柱流量不准；2）检测器基线波动脱气注意点：1）每天脱气；2）混合溶剂脱气时间不能过长必须做! 溶剂前处理

第24页：高压输液泵1.每次

高压输液泵1.每次

• 高压输液泵
• 每次使用后要把泵中的缓冲液洗干净，防止盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中。
• 使用HPLC级的流动相试剂。
• 使用不锈钢烧结吸液滤头。

第25页：高压进样阀必须做!每

2、高压进样阀必须做!每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐。防止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子。严禁用!严禁使用气相色谱那样的尖头针进样。

第26页：紫外检测器的维护

紫外检测器的维护

• 紫外检测器每次做
• 流过池每次使用后连同色谱柱一起清洗
• 使用脱过气的流动相,防止气泡卡在流过池内。经常做不定期的使用空流过池校正波长。

第27页：操作极限预防1.严禁

操作极限预防1.严禁

• 操作极限预防
• 严禁在无流动相时启动高压输液泵.
• 设定泵的上限压力(≤25Mpa)防止长期压力过高损坏泵和进样阀.
• 设定泵的下限压力
• 5~1Mpa)防止流动相抽干和严重泄漏.

第28页：预柱与保护柱

5、预柱与保护柱从泵来的流动相预柱进样器保护柱分析柱到检测器

第29页：带整体过滤片的保护柱

使用保护柱带整体过滤片的保护柱

第30页：色谱柱的清洗步骤

步骤1

使用含盐缓冲液后（如离子对试剂）应用溶解性强的溶剂（如水）进行冲洗步骤2：先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗。对于反相色谱柱，可使用甲醇，乙睛四氢呋喃，氯仿，庚烷等，在此条件下，应避免溶剂的pH 低于2 或高于8若经过步骤1 和步骤2 后，压力仍没下降至步骤36、柱堵塞的修复

第31页：色谱柱清洗步骤3

步骤3

• 若压力稳定下降，至步骤4（2）若压力不下降，至步骤5步骤4：保持色谱柱反方向连接，用低于
• 5 ml/min 流速冲洗1 小时若步骤4 不能降压，至步骤
• 柱堵塞的修复

第32页：色谱柱清洗步骤5

步骤5

若内置过滤器被堵塞，应冲洗或更换。柱连接端的拆卸或重装会导致柱效下降（有效塔板数下降和不对称峰）若步骤5 不能降低柱压，至步骤6步骤6：若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。（2~5mm）6、柱堵塞的修复

第33页：五、FL2200型液

五、FL2200型液

• 高压输液泵
• 高压进样阀
• 液相色谱柱
• 紫外检测器
• 溶剂箱

第34页：高压输液泵输液系统

1、高压输液泵输液系统

第35页：高压输液泵

2、高压输液泵

第36页：样品完全溶解在流动相中

样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小六、常见峰问题1、样品制备

第37页：峰形问题（双峰）柱头

2、峰形问题（双峰）柱头塌陷或柱床运动。泵头过滤芯(Frit)部分堵塞。组份共流出正常双峰柱头塌陷

第38页：静态混合器与噪音

问题

一个有紫外吸收的流动相与一个没有紫外吸收的流动相动态混合产生噪音，增加静态混合器可以降低这种噪音。缺点:增加了延迟体积静态混合器3、噪音

第39页：检测池脏

检测池脏检测池灯能量下降由泵引起的脉冲检测器上的温度效应检测池中有气泡通过Time (min.)4、基线噪音

第40页：基线漂移梯度洗脱引起

5、基线漂移梯度洗脱引起的温度不稳定（RID）流动相脏柱子没有用流动相平衡系统中污染物溢出

第41页：鬼峰

6、鬼峰20% ～100% MeOH梯度洗脱，没有进样鬼峰：没有进样就有色谱峰出现。原因－流动相脏

第42页：柱外扩展用较短的、窄

7、柱外扩展用较短的、窄内径的毛细管连接进样器和色谱柱以及柱子和检测器。确认连接管的接头都相互匹配。使用死体积小的流动池减小进样量增加柱外死体积

第43页：峰扩展所有峰都扩展柱

8、峰扩展所有峰都扩展柱效降低或有柱塌陷进样体积过大流动相粘度大部分峰扩展前一次分析样品的流出物高分子量样品－蛋白质或聚合物

第44页：拖尾因子与峰形评价

拖尾因子与峰形评价：下表列出相关数据。

拖尾因子＞1.2为拖尾峰，＜0.9为前伸峰。

第45页：拖尾柱头有污染物堆积

拖尾柱头有污染物堆积

• 拖尾柱头有污染物堆积重金属反应所有峰均拖尾柱子失效小峰在大峰后洗脱出来部分峰拖尾二次保留效应残留硅醇的相互作用拖尾因子＞
• 2

第46页：正常前伸10、前伸峰

正常前伸10、前伸峰

• 前伸峰柱子过载小峰在大峰之前洗脱出来拖尾因子＜
• 9

第47页：负峰溶解样品的溶剂

11、负峰溶解样品的溶剂通过柱子时平衡被破坏样品吸收比流动相吸收小。RID中最常见正常负峰

第48页：七、压力问题

七、压力问题压力问题压力过高压力过低压力波动

第49页：压力过高柱子进口过滤

1、压力过高柱子进口过滤芯被污染PURGE阀过滤芯被污染色谱柱被污染连接管路，尤其是针座毛细管堵塞进样器旋转密封阀被堵塞进样针或针座被阻塞压力测量使用此阀分割系统

第50页：溶剂进口过滤芯堵塞

溶剂进口过滤芯堵塞连接管路泄漏或其它备件（泵密封垫）溶剂或流速改变主动阀失灵四元比例阀失灵单向出口阀失灵色谱柱失效(固定相)2、压力过低压力测量溶剂进口过滤芯

第51页：压力波动的原因

溶剂进口过滤芯3、压力波动溶剂进口过滤芯堵塞溶剂未脱气泵的密封垫老化出口单向阀失效主动阀失效*通常是：泵内有气泡

第52页：八、各种峰形的处理

液相色谱各种峰形的处理：本页为表格页，源文件文字与数字粘连严重，无法安全切分为表格。

说明：本页表格（液相色谱各种峰形的处理）未能自动还原，建议对照原课件图片人工补全表格数据。

第53页：各种峰形的处理（2）

液相色谱各种峰形的处理：本页为表格页，源文件文字与数字粘连严重，无法安全切分为表格。

说明：本页表格（液相色谱各种峰形的处理）未能自动还原，建议对照原课件图片人工补全表格数据。

第54页：各种峰形的处理（3）

液相色谱各种峰形的处理：本页为表格页，源文件文字与数字粘连严重，无法安全切分为表格。

说明：本页表格（液相色谱各种峰形的处理）未能自动还原，建议对照原课件图片人工补全表格数据。

第55页：知识窗：重叠峰的测量

知识窗重叠峰在测量上有困难，可用计算机方法进行拟合色谱峰的测量

第56页：本章复习思考题

本章复习思考题

• GC与HPLC的比较
• 流动相的选择
• 液相色谱柱的保养
• 常见峰问题