13 酶抑制剂和免疫法.ppt

第1页：第六章酶抑制法和免疫测定技术

第六章酶抑制法和免疫测定技术

第2页：本章目的要求

目的要求

生物测定技术以其简单、快速、特异性强、样品量少而得到迅速发展，应用酶抑制技术、酶联免疫技术、生物技术等快速测定农药残留，已成为一定的市场需求，但此类方法仍只能达到定性和半定量的水平。通过本章的学习，目的是使学生掌握酶制技术、酶联

第3页：第六章酶抑制法和免疫

第六章酶抑制法和免疫

• 酶法概述
• 酶法检验原理
• 酶原
• 底物与显色剂
• 测定方法二、免疫检测技术
• 免疫反应
• 免疫分析
• 酶联免疫吸附测定法
• 农药抗体制备
• ELISA法的特点

第4页：一、酶抑制分析测定法

一、酶抑制分析测定法1、酶法概述

第5页：真性胆碱酯酶与胆碱能

真性胆碱酯酶与胆碱能神经的生理功能极为密切。其生理功能是，当神经冲动到达胆碱能神经末梢时，突触小泡内的Ach外排至突触间隙，作用于突触后膜的胆碱能受体，引起下一级神经元或效应器的激发。在正常生理条件下，Ach完成传递冲动作用后，随即被突触后膜上的AchE在数毫秒内水解，生成乙酸和胆碱。2、酶法检验原理

第6页：神经性毒剂分子中含有

神经性毒剂分子中含有

• 1，O＝
• 5，F＝
• 0，C&S＝
• 5)。因此，相对电负性大的O、F原子吸收电子成为负极，使P成为低电子密度的正极，即P原子带有较多的正电荷和更强的亲电子能力。所以神经性毒剂对AchE有更大的亲和力和抑制力。
• 神经性毒剂对AchE的抑制机理

第7页：胆碱酯酶

胆碱酯酶根据其水解基质的专一性和速度不同分真性胆碱酯酶和假性胆碱酯酶，前者又称乙酰胆碱酯酶(AchE)，后者包括丁酰胆碱酯酶(BuchE)和丙酰胆碱酯酶(PrchE)。假阳性：水果、蔬菜的提取物中含有对有抑制作用的杂质，如氯代烟碱类物质。(2)对胆碱酯酶的抑制作用①假阳性

第8页：敌敌畏乙酰胆碱Ach

敌敌畏乙酰胆碱AchE②产生假阳性的作用机理

第9页：酶原：蜜蜂头脑酯酶液

3、酶原蜜蜂头的脑酯酶液条件

• 酶原蜜蜂头的脑酯酶液条件：3日龄，-20℃
• 24g/ml磷酸缓冲液（pH7.5）保质期：3个月

第10页：底物与显色剂：乙酰胆碱法

底物与显色剂：乙酰胆碱法

• 底物与显色剂乙酰胆碱+H2O→胆碱+乙酸pH为
• 2（黄）→
• 6（蓝色）
• 乙酰胆碱-溴百里酚蓝

第11页：底物与显色剂：乙酸-β-萘酯法

乙酸-β-萘酯固蓝B盐+H2O→β-萘酚+乙酸（紫红色）（2）乙酸-β-萘酯固蓝B盐

第12页：3）乙酸羟基吲哚显色

（3）乙酸羟基吲哚显色法乙酸羟基吲哚+H2O→吲哚酚+乙酸吲哚酚+O2→靛蓝（蓝色）

第13页：4）乙酸靛酯显色法乙

（4）乙酸靛酯显色法乙酸靛酯+H2O→靛酚蓝（蓝色）+乙酸

第14页：水解加酶显色剂未

水解加酶显色剂未

• 测定方法
• 测定原理无农药有农药

第15页：测定方法加入20ml

测定方法加入20ml

• 测定方法加入20ml提取试剂提取取2g样品（非叶菜类取4g），切碎取样振荡1~2min抑制反应将上清液倒入试管中，静止3min，加入50ul酶，3ml样品提取液，50ul显色剂培养倒入比色杯测定仪器测定
• 比色法

第16页：3）、酶片法酶片为浸

（3）、酶片法酶片为浸渍有胆碱酯酶的或其他敏感酯类的滤纸片或类似载体物质，其基本技术原理与比色法相同。

第17页：技术问题

6、技术问题（1）分析对象

• 技术问题
• 分析对象：有机磷、氨基甲酸酯类
• 灵敏度不高，需用GC进一步定性和定量、重现性不好
• 农药含量影响酶抑制程度
• 影响因子：酶的浓度、温度、pH

第18页：二、免疫检测技术

二、免疫检测技术Pathogen

第19页：免疫反应

1、免疫反应免疫反应

细菌、病毒→入侵→抵御的抗体，即识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性反应。抗原：外来物

第20页：免疫分析

2、免疫分析免疫分析

以抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法。免疫反应特点：高度选择性。

第21页：酶联免疫吸附测定法E

3、酶联免疫吸附测定法ELISA（Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)原理：在测定过程中，样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。（加入显色剂）

第22页：1）、直接ELISA

（1）、直接ELISA原理AgAg *AbSPAbAb：Ag：Ag *

第23页：2）、间接ELISA

2）、间接ELISA原理AgAb*SPAg

AbAgAg：AbAb*Ag：Ab：Ab*

第24页：农药抗体制备Anti

4、农药抗体制备Antibody（Ab）

动物肌体某些活性细胞在某些物质（抗原）刺激下产生，并能与这些物质特异性结合的一类活性物质。

第25页：ELISA法的特点

ELISA法的特点

• ELISA法的特点
• 适用于常规方法无法测定的农药
• 适用于环境监控
• 适用于单一农药品种残留检测

第26页：本章复习思考题

本章复习思考题

• 酶抑制法测定农药残留的基本原理是什么？
• 免疫分析法应用于农药残留检测的关键问题是什么？
• 农药快速检测技术的检测原理是什么？