21 第五章 鱼精的利用.5.ppt

第1页：第五章 鱼精的利用

第五章鱼精的利用自鱼精中提取DNA-Na鱼精蛋白

第2页：一、自鱼精中提取DNA-Na

一、自鱼精中提取DNA-Na（一）、概述DNA及其钠盐（DNA-Na）是遗传工程研究的重要材料，也是常用的生化试剂和医药制品的原料。由DNA降解而成的5′—脱氧核甘酸，在遗传工程上可用来合成一级结构模拟药物，在临床上能控制一些贵遗传复制失调的疾病；在医药学上，可作为类抗病毒物，能起到调节细胞功能，对治疗急慢性肝炎、肾炎、肌肉萎缩、心血压计管病、血小板减少症和白血球减少症均有一定疗效；还可作为一类抗癌新药畏助应用于临床。

第3页：DNA的制备历史

DNA的制备历史

• DNA的制备历史：
• 在五十年代是Zamenhoff等用不同方法从生产牛肉膏的下脚料小牛胸腺中提取的，后来牛肉膏被蛋白胨取而代之。
• 人们开始不断地探寻新的生产原料和方法。/国外亲从各种微生物中分离制取过DNA，但由于原料来源不便，未能广泛采用。
• 1972年德国专利报告了鲱鱼精巢DNA的制备。

第4页：•在我国，早在1958年，中国科学院、上

•在我国，早在1958年，中国科学院、上海鱼品厂等就以黄鱼精巢为原料制取了DNA-Na。80年代前后，浙江水产学院分别由鲐鱼、蓝圆鲹、大黄鱼和马面的精巢中提取了DNA-Na，并对其制备工艺进行了成功的筛选研究。

第5页：（二）

（二）

• （二）、原料制备DNA的原料应该符合下列几个条件：
• 1、DNA含量高而且不源方便；
• 2、原料内活性去氧化核糖核酸酶的含量应该低，否则在原料贮藏及制备过程中，引起DNA的解聚作用；
• 3、原料中其它杂质，如RNA、杂蛋白质及碳水化合物等含量要少，否则使提纯过程延长；

第6页：•4、DNA与蛋白质之间的结合强度应该是

•4、DNA与蛋白质之间的结合强度应该是

• 4、DNA与蛋白质之间的结合强度应该是较弱的，否则难以分离DNA与蛋白质，在用变性剂去蛋白质时，往往要重复多次主能把蛋白除尽。多年来的实践证明，除了犊牛胸腺外，水产品中，淡水鱼，鱼等精巢均是较理想的原料，其次为蓝圆、大黄鱼和马面鱼精巢。
• 根据上面四个原则，很自然地提出了对原料新鲜度的要求，因为新鲜的才不会被解聚。而要想达到DNA含量高的要求，则必须在适当的生长时期采集，并且要设法抑制Dnase的解聚活力。

第7页：（三）

（三）

• （三）、DNA-Na提取工艺制取DNA-Na的具体方法很多，但各种方法最根本的均可归结为下面几步：
• 第一步：借机械或化学的历代法把组织的细胞破坏，并从中分离出纯净的DNA-蛋白质。
• 第二步：以DNA-蛋白质为原烂漫，把它分成DNA与蛋白质两部分。
• 第三步：把DNA部分由离心分出（离心液），并对其重复纯化，去除蛋白质等杂质。
• 第四步：将DNA钠盐干燥。

第8页：•酚与CHCL3-5%SDS复合法，是浙

•酚与CHCL3-5%SDS复合法，是浙江水产学院在吸取国外各种方法长处的基础上，经筛选改进而提出的适合工业化生产的制备工艺，它具有产率高，质量稳定，操作方便，周期短，成本较低诸优点。

第9页：工艺流程原料→匀浆→搅拌→酚法变性→静置

工艺流程原料→匀浆→搅拌→酚法变性→静置

工艺流程原料→匀浆→搅拌→酚法变性→静置→离心或过滤→用5%SDS与CHCL3作第二次变性→离心或过滤→析出DNANa纤维→洗涤→真空干燥→产品检验→成品及其包装

第10页：操作要点

操作要点：1、原料处理对新鱼或冻藏鱼精除去污物和结缔组织。2、匀浆以原料与高盐溶液（2MnaCL-0.015M柠檬酸三钠溶液）比为1:3加入高盐液，以12000r/min×1′45″匀浆。3、第一次变性以原料与酚饱和溶液比为1：0.8后加速离心（3200r/min×30′）

第11页：4、第二次变性取上述离心后的上清液稀释至

4、第二次变性取上述离心后的上清液稀释至20-30倍（以鱼精原料为基础程），加紧入其1/9体程（以20倍稀释时）的混合变性剂（5%SDS，CHCL3=1：2），同时加入固体NaCL，使整个体系氯化钠浓度保持1M。搅拌变性1h后，静置6-12h，离心。5、DNA-Na的析出、洗涤和干燥将二次变性后所得的上清液，徐徐倾入1倍体积的95%乙醇中，用两个容器往复倾倒几次，纤维状的DNA-Na就析出，将析出的DNA-Na依次用95%的乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤二次后，迅速用P2O5进行真空干燥。

第12页：（四）

（四）

（四）、5′-脱氧核酸的分离与精制•工艺流程：鱼精DNA-Na→配成1%（w/v）溶液→100℃沸水浴热变性10分钟→速冷→72℃±0.5酶解1.5h升温至100℃，10min→速冻→过滤→滤液（测酶解率）→上201×8柱（同时脱氧核苷等穿漏）→用不同洗脱液脱分离（洗脱顺序为DcmpdAMPTMPdGMP）→收集的各种洗脱液用炭柱浓缩→一级真空浓缩→冷冻升华干燥→两级真空浓缩→用冷酒精析出→洗涤→结晶→真空干燥→结晶成品→成品检验。

第13页：•方法要点1、核酸酶P1用P. citr

•方法要点1、核酸酶P1用P. citr

• 方法要点
• 1、核酸酶P1用P. citrinum M71 经紫外线变异筛选后的菌株，采用液体培养制得的，滤过液酶活每ml对DNA在100单位上下，对RNA为300多单位。

第14页：2、酶解反应取定量热变性DNA-Na 液

2、酶解反应取定量热变性DNA-Na 液，以0.1N HCL 调Ph5.0±0.1，72℃预热，加Ph5.0±0.1的0.2M HAL-Ma 液5%（v/v），加0.05M ZnCL2 0.028%( v/v),酶解时DNA-Na浓度为0.5%-0.1%,加酶液（1mgNAD-Na,酶活10u）,计时并始终维持72℃±0.5℃ 1.5h,煮沸10min终止酶反应，急冷至室温。过滤后，用5%氨水调pH8-9，再过滤后作上清液检验（用磺基水杨酸检查去沉淀程度）并作纸层析鉴定，余者低温贮藏待用。

第15页：3、离子交换柱层析分离201×8柱（20

3、离子交换柱层析分离201×8柱（200-400目）按常规预处理并转成氨型，用5%氨水调pH8-9，装柱，抽去气泡、平衡。洗脱时，用0.0018N（附近）HCL、0.0028N HCL，分别洗出dCMP和dAMP，后用pH6.0的0.036N NaCL洗脱Dtmp，最后用0.02N NaCL 洗脱Dtmp，最后用0.2N NaCL 和0.005 N HCL 溶液洗脱Dgmp

第16页：4、炭柱处理按常规用蒸馏水浸泡过夜，在1

4、炭柱处理按常规用蒸馏水浸泡过夜，在1N，NaOH中煮沸15min,用蒸馏水洗至中性，再用1NHCL煮沸15min，并用蒸馏水洗至pH3.0；装柱、平衡。每ml活化活性炭交换22mgDnmp,上样流速1.9-2.6ml/cm2min最后洗脱用5%NH3H2O:45%H2O:50%的95%乙醇的混合物，流速0.2-0.4ml.cm2min洗至OD260为0.55以下。

第17页：5、真空浓缩（1）第一级真空浓缩浓缩液的

5、真空浓缩（1）第一级真空浓缩浓缩液的蒸馏瓶置于水浴锅中（45℃）冷凝器集液瓶集液瓶安全瓶干燥器（两级）安全瓶（带真空表）真空泵。目的是除去氨水、酒精和部分水。（2）第二级真空浓缩将一级浓缩液快速离心，真空度740mmHg以上、温度50℃左右，转速3000r/min.然后蒸发去水分，其水分经干冰冷凝器，至干燥，安全瓶，最后经真空泵抽出，结果使物料由液态浓缩成粘稠状。

第18页：然后对

然后对Dcmp，调至pH2.7，对其他三种核酸，则调至微碱性。再用酒精析出，析出时置于0℃冷间，离心得到沉淀置于真空干燥器干燥，视色泽深浅采取进一步纯化措施（用酒精洗涤），最后得到无定形结晶成品。

第19页：二、鱼精蛋白

二、鱼精蛋白（一）、概述鱼精蛋白又名精蛋白，是分子最较小（约4000-10000道尔顿）的简单蛋白质。它存在于雄性鱼类成熟精子中，常跟DNA较紧密地结合在一起。此种结合能被强酸解离。鱼精蛋白按构成精蛋白分子中有几种碱性氨基酸不定分类。一元精蛋白质仅含精氨酸一种碱性氨基酸；二元精蛋白除了含精氨酸外还有赖氨酸或组氨酸；三元精蛋白含有三种碱性氨基酸。

第20页：在鱼精蛋白质中没有酪氨酸

在鱼精蛋白质中没有酪氨酸（故对Millon反应呈阴性）、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。它能和多种矿酸结合成盐。它能溶于水、稀氨水、酸和碱；加热不凝固且较为稳定。它能与多种蛋白质结合形成复合物，因而可以被用来制造长效降血糖激素制剂——鱼精蛋白胰岛素锌盐，也可制成抗生素复合物，抑制肿瘤周围血管的增长。还用于临床作肝素制剂和人工合成的抗凝血剂的解毒剂等。此外，它对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，与其他辅料一起，对水产品、淀粉类等食品有良好的防腐作用。其硫酸盐可用来分离、纯化核酸、酸性和碱性蛋白。

第21页：鱼精蛋白提取工艺的研究

鱼精蛋白提取工艺的研究

• 鱼精蛋白提取工艺的研究
• 经典的提取方法一般是将提取过程分两大步：即先提取精子头，再从中提出鱼精蛋白。
• 提取精子头，常用方法有Felix分离法和Ando。
• Felix法是应用质壁分离原理使精子头部离尾丝和细胞质之后经离心所得悬浊液中加入柠檬酸（最终浓度为0.003%）,得精子头白色沉淀，然后复以有机溶剂脱脂、干燥得到纯粹精子头。

第22页：•Ando法是利用脱氧核糖蛋白即精子头成

•Ando法是利用脱氧核糖蛋白即精子头成

• Ando法是利用脱氧核糖蛋白即精子头成分在0.14mol与1-2mol NaCL溶液中不同溶解中的不同溶解度来分离，再用乙醇析出核精蛋白。此外，还有在等渗盐中用创分段离心法也可分离得到。
• 在取得精子头后，鱼精蛋白部分的提取无论经典的或现代的方法，基本上是矿酸为主要抽提剂，以柠檬酸盐或有机溶剂为纯化剂。如拉斯姆森法，将精子头在冷的0.2mol盐酸中研磨取得抽出液，再用0.125mol苦味酸钠溶液将鱼精蛋白转换为苦味酸盐黄色沉淀，接着以丙酮法清洗，加H2SO4使转化为硫酸盐，最后用乙醇沉淀得其硫酸盐产品。而Ando法则在精子头的0.2mol盐酸抽出液中用Amberlite-400（HCO3-型）中和酸度，将滤液冷冻干燥即可。

第23页：•有机溶剂法，它采用大量的有机溶剂（丙酮

•有机溶剂法，它采用大量的有机溶剂（丙酮、乙醇、氯仿等）进行反复脱水、脱脂、抽提、洗涤鱼精蛋白，其间辅以硫酸钠、氨水、过氧化氢、EDTA二钠盐等试剂，再经活性炭脱色，强强性苯乙烯阳离子交换树脂处理，其操作繁琐，成本高昂，虽然产品质量好但成品得率低。

第24页：•在最近几年中，鱼精蛋白的提取工艺有了较

•在最近几年中，鱼精蛋白的提取工艺有了较大的改进与简化，尤其是日本。如在得到鱼精蛋白盐类的方法中，有将鱼精在稀矿酸液中处理，抽提出鱼精蛋白及混杂蛋白。然后在抽出液中加入甲醇或乙醇之类的有机溶剂以沉淀上述蛋白，分离子干燥后的固体溶于温水中，再冷却析出鱼精蛋白盐类。

第25页：•在该工艺中，有机溶剂同样也会沉淀杂蛋白

•在该工艺中，有机溶剂同样也会沉淀杂蛋白，这就势必要进一步设法除去杂蛋白。尽管在温水中溶解后能析出鱼精蛋白，但同时也一定程度地混入杂蛋白而影响纯度，这样仍需补充精制步骤。也有在矿酸抽出剂中不用有机溶剂而用聚磷酸盐，使鱼精蛋白以磷酸盐形式沉淀出来，然后将沉淀溶解在高浓度的硫酸铵中，复分解为精蛋白硫酸盐。然该法需中途取出沉淀再溶解，影响了操作的流水性。同时，同上法一样，也会有杂蛋白与鱼精蛋白一起沉淀而影响纯度。为此采用活性炭之类的吸附剂除去杂质，再用有机溶剂沉淀得到成品，操作繁杂、成本高。

第26页：•各国对鱼精蛋白的研究，多以鲑科鱼类为对

•各国对鱼精蛋白的研究，多以鲑科鱼类为对象，前苏联是用大麻哈鱼和细鳞大马哈鱼的精巢为原料。而我国由于鲑科鱼类的产量较少，因此从1958年开始，上海和青岛等地的水产科学研究部门，曾多次利用黄色精巢与淡水鱼的鲤鱼精巢提取鱼精蛋白，并获得成功。八十年代和九十年代浙江水产学院食品科学研究所又从鲐鱼和金枪鱼和淡水鲢鱼精巢中成功地提取了鱼精蛋白。这样就解决了我国生产鱼精蛋白原料不足的问题。

第27页：（二）

（二）

• （二）、原料特征
• 对于提取鱼精蛋白作用的原料要求较高。要新鲜而成熟，一经排过精液的精巢，即不能利用。
• 对原料的保藏要采取妥善的方法。根据实验发现用新鲜原料提取鱼精蛋白的收得率要比冰冻过的原料高。这是因为在冰冻和解冻过程中部分鱼精蛋白流失的结果。性腺的成熟度对成品率的影响更大。根据前苏联海洋渔业与海洋研究所发表的资料（见下表）中可看到：成熟度不大的精巢，其成公差异很大：精巢成熟时，其含氮量增加。

第28页：•精巢蛋白质的成分很不稳定，它随着性腺的

•精巢蛋白质的成分很不稳定，它随着性腺的

• 精巢蛋白质的成分很不稳定，它随着性腺的成熟变化很大，精巢成熟时，二氨基酸含量增加，且其含量的增加主要是由于精氨酸的增加。
• 在鱼精蛋白中没有酷氨酸（对Millon反应呈阴性）、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。

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（三）

• （三）、提取工艺
• 鱼精蛋白矿酸盐（以鱼精蛋白硫酸盐为例）鱼精蛋白通常主要以DNA-蛋白质的形式聚集于鱼类精子中，但这种核蛋白的结合链并不牢固，能被硫酸等强酸所解离而释出易溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂的鱼精蛋白硫酸盐，其提取工艺如下：

第30页：原料鱼精→绞碎→过滤→醋酸酸化→沉淀→压

原料鱼精→绞碎→过滤→醋酸酸化→沉淀→压

原料鱼精→绞碎→过滤→醋酸酸化→沉淀→压滤→酒精洗涤沉淀→过滤→潮固体品→硫酸抽提→过滤→加硅藻土过滤→酒精沉淀→离心分离→粗鱼精蛋白硫酸盐→水溶解→过滤→NaOH碱化→沉淀→加温→过滤→滤液静置→油状沉淀→硫酸溶解→过滤→乙醇处理→沉淀→丙酮、乙醚洗涤→真空干燥→鱼精蛋白破酸盐成品→用注射水溶解→配料→无菌过滤→灌封→鱼精蛋白硫酸盐注射液。

第31页：上述生产工艺要点

上述生产工艺要点：（1）原料处理将新鲜成熟的鱼精绞碎后，加入一定量水搅拌1h后，用尼龙纱布滤除结缔组织等。再加冰醋酸在乳白色滤液中，使滤液呈酸性，鱼精蛋白沉淀，然后压滤；加入药用酒精洗涤沉淀物，过滤即得潮固体品。

第32页：（2）硫酸提取将潮固体品加一定量10%H

（2）硫酸提取将潮固体品加一定量10%H2SO4至糊状物的酸浓度达4%-5%，搅拌2h，使鱼精蛋白与核酸分离。过滤去滤渣，再加少量藻土，用纸浆过滤得稍微混浊的鱼精蛋白质硫酸盐溶液，然后加酒精至溶液中含醇量达70%-72%，置0℃下8-12h，离心得粗制鱼精蛋白硫酸盐沉淀物。

第33页：（3）精制将上述粗制品加入无热源馏水加热

（3）精制将上述粗制品加入无热源馏水加热溶解，加少量硅藻土趁热过滤，滤液再在水浴中加热至80℃，滴加1NNaOH溶液至pH9.0左右，0.5h后趁热过滤，滤液在0℃下静置24h，有油膏状物质沉集底部，倾去上清液，然后再用3倍药用酒精，在0℃下静置8-12h，离心所得沉淀，用药用丙酮洗涤3-4次，再用乙醚洗1次，最后真空干燥，得鱼精蛋白硫酸盐成品。若再配料（加入氯化钠及苯酚和适量1N硫酸）、灌封等加工，则可生产出注射剂。

第34页：2、离子交换法将经过处理的强碱性苯乙烯离

2、离子交换法将经过处理的强碱性苯乙烯离

2、离子交换法将经过处理的强碱性苯乙烯离子树脂装柱。•鱼精原料→洗涤、沥干→捣碎→加硫酸搅拌→离心取上清液→上柱分离→洗脱→减压干燥或冷冻干燥→鱼精蛋白硫酸盐成品。

第35页：硫酸鱼精蛋白质粉末

硫酸鱼精蛋白质粉末，易溶于水，不溶于乙醇或乙醚等有机溶剂。注射用的质量标准：（1）鱼精蛋白硫酸盐的生理氯化钠注射液，每ml内含：（2）每mg鱼精蛋白抵消肝素抗凝作用不得低于70肝素；（3）含氮量为20%-30%；（4）热源试验应符合我国药典之规定；（5）外观应为无色透明液体。

第36页：思考题

思考题

• 思考题1、什么是DNA及其钠盐（DNA-Na）？
• 怎样从鱼精中得到？
• 2、什么是鱼精蛋白？
• 试述其提取工艺及操作要点？
• 3、提取鱼精蛋白的原料有哪些特征？