09 第八章 吸光光度法.8.ppt

第1页：第八章 吸光光度法

第八章 吸光光度法

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第2页：实验数据记录表

实验数据记录表：本页为实验记录表格，下表按原文出现的记录项目逐项整理。

说明：原课件本页为粘连的实验记录表格模板，上表按原文记录项目拆分还原，各次测定的具体数值请对照原课件图片填写。

第3页：8.1 吸光光度法的基本原理·特点

8.1 吸光光度法的基本原理·特点

• 8.1 吸光光度法的基本原理
• 灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L, 10-4%～10-5%
• 准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（1～2％）
• 操作简便快速
• 应用广泛吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。

第4页：1.光的基本性质电磁波的波粒二象性

1.光的基本性质电磁波的波粒二象性

• 1.光的基本性质电磁波的波粒二象性c－真空中光速2.99792458×108m/s~3.0 ×108m/sλ－波长，单位：m,cm,mm,
• m,nm,Å1
• m=10-6m, 1nm=10-9m, 1Å=10-10mν－频率，单位：赫芝（周）Hz 次/秒n－折射率，真空中为1光的传播速度:波动性

第5页：磁场向量电场向量传播方向YZX与物质作用

磁场向量电场向量传播方向YZX与物质作用

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第6页：微粒性h－普朗克(Planck)常数

微粒性h－普朗克(Planck)常数

• 微粒性h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J
• －频率E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 光量子，具有能量。

第7页：波粒二象性结论

波粒二象性结论

一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低。单色光：具有相同能量(相同波长)的光。混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起。真空中:

第8页：光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远

光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远

• 光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780 nm~2.5
• m2.5
• m~50
• m50
• m~300

第9页：3. 溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱

3. 溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱→/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光

第10页：300400500600700→/nm3

300400500600700→/nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2AbsorbanceCr2O72-、MnO4-的吸收光谱350

第11页：苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯

苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯(254nm)甲苯(262nm)A→230 250 270

第12页：4. 光吸收基本定律

4. 光吸收基本定律

• 4. 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律
• (1760)A=lg(I0/It)=k1b比尔定律
• (1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介质厚度(cm)

第13页：T－透光率

T－透光率（透射比）（Transmittance）A= lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT= kbc

第14页：吸光度A、透射比T与浓度c的关系

吸光度A、透射比T与浓度c的关系ATcA=kbc

第15页：K吸光系数

K吸光系数

• K吸光系数Absorptivitya的单位: L
• g-1
• cm-1当c的单位用g
• L-1表示时，用a表示，A＝abc
• 的单位: L
• mol-1
• cm-1当c的单位用mol
• L-1表示时，用
• 表示.
• －摩尔吸光系数Molar AbsorptivityA＝
• bc当c的单位用g
• 100mL-1表示时，用表示，A＝bc，叫做比消光系数

第16页：吸光度与光程的关系A= ·bc光源检测器

吸光度与光程的关系A= ·bc光源检测器

• 吸光度与光程的关系A=
• bc光源检测器0.00吸光度检测器b样品光源0.22吸光度光源检测器0.44吸光度b样品b样品

第17页：吸光度与浓度的关系A= ·bc吸光度

吸光度与浓度的关系A= ·bc吸光度

• 吸光度与浓度的关系A=
• bc吸光度0.00光源检测器吸光度0.22光源检测器b吸光度0.42光源检测器b

第18页：朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光应选用

朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光应选用

• 朗伯-比尔定律的适用条件
• 1.单色光应选用→max处或肩峰处测定
• 2. 吸光质点形式不变离解、络合、缔合会破坏线性关系应控制条件(酸度、浓度、介质等)
• 3. 稀溶液浓度增大，分子之间作用增强

第19页：x104→(nm)亚甲蓝阳离子水溶液的吸

·x104→(nm)亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱a. 6.36×10-6mol/Lb. 1.27×10-4mol/Lc. 5.97×10-4mol/L亚甲蓝阳离子单体→max= 660 nm二聚体→max=610 nm二聚体的生成破坏了A与c的线性关系

第20页：0 1 2 3 4 mg/mlA

0 1 2 3 4 mg/mlA

• 0 1 2 3 4 mg/mlA。。。。*0.80.60.40.20溶液浓度的测定A＝
• bc工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用

第21页：6. 吸光度的加和性与吸光度的测量

6. 吸光度的加和性与吸光度的测量A = A1 + A2 + … +An用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。

第22页：8.2 光度分析的方法和仪器

8.2 光度分析的方法和仪器

• 8.2 光度分析的方法和仪器8.2.1 光度分析的几种方法方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。观察方向
• 1.目视比色法c4c3c2c1c1c2c3c4

第23页：2. 光电比色法通过滤光片得一窄范围的光

2. 光电比色法通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)光电比色计结构示意图灵敏度和准确度较差

第24页：3. 吸光光度法和分光光度计光源单色器吸

3. 吸光光度法和分光光度计光源单色器吸收池检测系统稳压电源分光光度法的基本部件通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调, 故选择性好, 准确度高.

第25页：722型分光光度计结构方框图光源吸收池检

722型分光光度计结构方框图光源吸收池检测系统分光系统

第26页：分光光度计的主要部件光源

分光光度计的主要部件光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜:玻璃350～3200nm, 石英185～4000nm光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便

第27页：吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液

吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池紫外区：石英池检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管指示器：低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录

第28页：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同

棱镜

依据不同波长光通过棱镜时折射率不同单色器入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400

第29页：光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽

光栅

在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.

第30页：检测器SeAu，Ag半导体h·硒光电池

检测器SeAu，Ag半导体h·硒光电池

• 检测器SeAu，Ag半导体h
• 硒光电池Ag、Au

第31页：光电管红敏管625-1000 nm蓝敏管

光电管红敏管625-1000 nm蓝敏管200-625 nmNi环（片）碱金属光敏阴极h·

第32页：光电倍增管待扫描

光电倍增管待扫描160-700 nm1个光电子可产生106～107个电子

第33页：8.2.2 分光光度计的类型

8.2.2 分光光度计的类型

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第34页：多通道仪器

多通道仪器（Multichannel Instruments）光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管)photodiode arrays (PDAs) 同时测量200～820nm范围内的整个光谱, 比单个检测器快316倍,信噪比增加316 1/2倍.其他类型分光光度计将光度计放入样品中, 原位测量. 对环境和过程监测非常重要.纤维光度计

第35页：镀铝反射镜纤维光度计示意

镀铝反射镜纤维光度计示意图

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第36页：8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度一

8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度一

• 8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度一. 灵敏度的表示方法:摩尔吸光系数(
• )A=
• b c
• =A/bc(L
• mol-1
• cm-1)
• 越大, 灵敏度越高:
• 104～5×104 为中等灵敏度;
• >105为高灵敏度;
• <104为低灵敏度.

第37页：例1 邻二氮菲光度法测铁

例1 邻二氮菲光度法测铁

• (Fe)=1.0mg/L, b=2cm , A=0.38 计算
• 和解：c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3/55.85 =1.8×10-5mol/L

第38页：c =1.0mg/L=1.0×10-3

c =1.0mg/L=1.0×10-3 g /1000mL= 1.0×10-4g/100mL

第39页：二. 准确度

二. 准确度

• 二. 准确度—仪器测量误差光度计的读数误差一般为0.2～2％(ΔT),由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的ΔT引起的误差不同。100806040200T%
• T-透光率读数误差c
• c1c1
• c2c2
• c3c3><

第40页：1086420204060800.70.

1086420204060800.70.40.20.1 AT%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,A在0.15～1.0之间(调c, b, →)

第41页：8.4 显色反应与分析条件的选择

8.4 显色反应与分析条件的选择

• 8.4 显色反应与分析条件的选择：：：：助色团－NH2，－OH，－X （孤对电子）ne8.4.1 显色剂与显色反应O生色团：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N （共轭双键）πe无机显色剂: SCN-[Fe(SCN)]2+H2O2[TiO
• H2O2]2+有机显色剂:

第42页：有机显色剂

有机显色剂CH3－C－C－CH3HO－N N－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOHOHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸

第43页：显色反应的选择*灵敏度高，一般

显色反应的选择*灵敏度高，一般

• 显色反应的选择*灵敏度高，一般ε>104*选择性好*显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好,
• λmax>60 nm .*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。

第44页：8.4.2 显色条件的确定

8.4.2 显色条件的确定

• 8.4.2 显色条件的确定c(R)c(R)c(R)
• 1. 显色剂用量（c(M)、pH一定）Mo(SCN)32+浅红Mo(SCN)5橙红Mo(SCN)6-浅红Fe(SCN)n3-n

第45页：2. 显色反应酸度

2. 显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）pH1<pH<pH2pH

第46页：邻二氮菲－亚铁反应完全度与pH的关系

邻二氮菲－亚铁反应完全度与pH的关系

• 邻二氮菲－亚铁反应完全度与pH的关系Fe2++3RH＋H＋A柠檬酸c(R)≈[R´]=10-4mol
• L-1β3＝1021.3β3FeR3

第47页：无法显示该图片

无法显示该图片。pH3～8为适宜的酸度范围

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第48页：3. 数据记录表

3. 数据记录表：本页为实验记录表格，下表按原文出现的记录项目逐项整理。

说明：原课件本页为粘连的实验记录表格模板，上表按原文记录项目拆分还原，各次测定的具体数值请对照原课件图片填写。

第49页：8.4.3 干扰及消除

8.4.3 干扰及消除

• 8.4.3 干扰及消除Co2＋,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2 (蓝)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+
• (2)Sn2+Co(SCN)2SCN－测Co2＋(含Fe3+) : (掩蔽法)
• 1.化学法

第50页：Co2+, Zn2+,Ni2+,

Co2+, Zn2+,Ni2+, Fe2+CoR,ZnRNiR,FeRCoR, Zn2+,Ni2+, Fe2+钴试剂RH+测Co2＋:(生成络合物性质不同)如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。测Fe3＋:(控制pH)Fe3+, Cu2+FeSS （紫红）Cu2+pH 2.5SS

第51页：2. 物理法—选择适当的测定波长

2. 物理法—选择适当的测定波长515655415500钍-偶氮砷III钴-亚硝基红盐AA络合物络合物试剂试剂

第52页：1. 仅络合物有吸收，溶剂作参比。如

1. 仅络合物有吸收，溶剂作参比。如

• 1. 仅络合物有吸收，溶剂作参比。如phen—Fe2+标准曲线
• 2.待测液也有吸收，被测液作参比。如测汽水中的Fe
• 3. 显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。
• 4. 干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比.2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.--选择适当的参比溶液

第53页：8.5 吸光光度法的应用

8.5 吸光光度法的应用

• 1. 单一组分测定1) 金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟, Co-钴试剂2) 磷的测定: DNA中含P～9.2%, RNA中含P～9.5%, 可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4
• 12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄(
• 小)磷钼(V)蓝(
• 大)Sn2+

第54页：3) 蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等

3) 蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等4) 氨基酸测定—茚三酮(紫色化合物)5) 水质检测: NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+----6) 药物含量测定—比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7) 紫外吸收(UV): NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。

第55页：2. 多组分的测定

2. 多组分的测定·xl1, eyl1, exl2, eyl2由x,y标液在→1, →2处分别测得a)在→1处测组分x, 在→2处测组分yb) 在→1处测组分x; 在→2处测总吸收,扣除x吸收,可求yc) x,y组分不能直接测定A1=exl1bcx+ eyl1bcy(在→1处测得A1)A2=exl2bcx+ eyl2bcy(在→2处测得A2)

第56页：3. 光度滴定NaOH滴定对硝基酚

3. 光度滴定NaOH滴定对硝基酚

• 3. 光度滴定NaOH滴定对硝基酚pKa=7.15间硝基酚pKa=8.39
• pKa =1.24V1V2V(NaOH)/mL对硝基酚间硝基酚酸形均无色.碱形均黄色

第57页：典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光

典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。Vsp滴定剂吸收Vsp被滴物吸收Vsp滴定剂与待测物均吸收Vsp产物吸收

第58页：4. 络合物组成的测定(1)摩尔比法

4. 络合物组成的测定(1)摩尔比法

• 4. 络合物组成的测定
• (1)摩尔比法: 固定cM,改变cR1:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0

第59页：(2)等摩尔连续变化法

(2)等摩尔连续变化法:M

R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:2

第60页：表观形成常数的测定

表观形成常数的测定(设M、R均无吸收)0.5cM/cM:R=1:1A0Ac(M)=c(R)=cMmRn型?

第61页：5.一元弱酸离解常数的测定

5.一元弱酸离解常数的测定

• 5.一元弱酸离解常数的测定HL H＋＋LKa＝[H+][L]/[HL]高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得AHL＝εHL
• c(HL)；低酸度下，几乎全部以L存在，可测得AL ＝εL
• c(HL).代入整理：[HL][L]或配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A.

第62页：MO吸收曲线

MO吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa350400450500550600→/nmA曲线pH11.10, 1.3822.6533.0643.4853.9865.53,6.80由每份溶液的一对pH、A，可求得一个Ka, 取平均值即可.

第63页：MO离解常数的测定作图法

MO离解常数的测定作图法AHL3.32(pKa)123456ApH=pKapHAL0.60.40.20-0.2-0.4-0.63.04.0pH3.34

第64页：6. 双波长分光光度法消除干扰在

6. 双波长分光光度法消除干扰在

• 6. 双波长分光光度法消除干扰在→2，A→2=Ax2+Ay2在→1，A→1=Ax1+Ay1
• A= A→2-A→1=Ax2+Ay2–(Ax1+Ay1)=Ax2 –Ax1=
• AxAy2＝Ay1
• Ax =(
• x2－
• x1)bcx消除了y的干扰X被测Y干扰→2→1→1Ay1AX1Ay2AX2A→/nm´

第65页：双波长分光光度法消除浑浊背景干扰

双波长分光光度法消除浑浊背景干扰→1 →2AA→1-A→2= △A△A∝c例牛奶中微量Fe的测定

第66页：7. 导数分光光度法

7. 导数分光光度法(不要求)A~→图混合物导数光谱01234

第67页：常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定

常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定

• 1.氢氯噻嗪.2.硫酸双肼肽嗪
• 3. 盐酸可乐定
• 4.常药降压片250 290 330 →412312A

第68页：肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取方法

肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取方法

• 肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取方法：肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用6％的HClO4稀释，然后用GDX100大孔树脂萃取，用二氯甲烷5mL洗脱杀鼠剂，40℃挥干，剩余物用0.1mol
• L-1NaOH4mL溶解后，紫外导数光谱测定。A0.0cdabDa.空白肝普通光谱b.2.5 mg/L敌鼠溶液的普通光谱c.空白肝二阶导数光谱d.2.5 mg/L敌鼠溶液的二阶导数光谱

第69页：8.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关

8.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关

• 8.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系.吸收曲线—定性分析的基础。定量分析的基础—朗伯-比尔定律：A=
• bc=-lgT式中各参数的物理意义，定量计算。8.2了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本部件。8.3灵敏度的表示—摩尔吸光系数的意义和计算；准确度—适宜的测量范围、偏离比尔定律的原因。8.4显色反应及条件的确定:显色剂用量、酸度、时间、温度、干扰及消除。8.5应用:单一组分测定示例、多组分测定、光度滴定、络合物组成的测定、酸碱离解常数的测定。第八章小结